le test d’oxydase détecte la présence d’un système de cytochrome oxydase qui catalysera le transport d’électrons entre les donneurs d’électrons dans les bactéries et un colorant redox – tétraméthyl-p-phénylène-diamine. Le colorant est réduit à une couleur violet foncé., Ce test est utilisé pour aider à l’identification de Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella et Pasteurella, qui produisent tous l’enzyme cytochrome oxydase.

Un certain nombre de réactifs peuvent être utilisés pour ce test.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Les organismes qui contiennent du cytochrome c dans le cadre de leur chaîne respiratoire sont oxydase-positifs et virent le réactif bleu/violet. Les organismes dépourvus de cytochrome c dans le cadre de leur chaîne respiratoire n’oxydent pas le réactif, le laissant incolore dans les limites du test, et sont oxydase-négatifs.

Les bactéries oxydase positives possèdent une cytochrome oxydase ou une indophénol oxydase (une hémoprotéine contenant du fer). Les deux catalysent le transport des électrons des composés donneurs (NADH) vers les accepteurs d’électrons (généralement l’oxygène)., Le réactif d’essai, le dichlorhydrate de n, N, N’, N’-tétraméthyl-p-phénylènediamine, agit comme un accepteur artificiel d’électrons pour l’enzyme oxydase. Le réactif oxydé forme le composé coloré indophénol bleu.

le système cytochrome n’est généralement présent que chez les organismes aérobies capables d’utiliser l’oxygène comme récepteur final de l’hydrogène. Le produit final de ce métabolisme est l’eau ou le peroxyde d’hydrogène (décomposé par la catalase).

but/utilisations du Test D’oxydase

• Le test d’oxydase est utilisé pour déterminer si un organisme possède l’enzyme cytochrome oxydase.,
• Le test est utilisé comme aide à la différenciation des espèces de Neisseria, Moraxella, Campylobacter et Pasteurella (oxydase positive).
• Il est également utilisé pour différencier les pseudomonades des espèces apparentées.

Procédure du Test D’oxydase

Il existe de nombreuses variantes de méthode au test d’oxydase. Ceux-ci incluent, mais ne sont pas limités à, l’essai de papier filtre, la méthode directe de plat, la méthode d’écouvillon, la méthode imprégnée de bande d’essai d’oxydase et la méthode de tube à essai. Tous les temps et concentrations sont basés sur les recommandations originales.,

à Sec Méthode du Papier Filtre

Depuis le oxydase réactif est instable et doit être fraîchement préparé pour l’utilisation, cette méthode est pratique.

1. Une bande de papier filtre Whatman’s no.1 est trempée dans une solution à 1% de dichlorhydrate de tertraméthyl-p-phénylène-diamine fraîchement préparée.
2. après avoir vidangé pendant environ 30 secondes, les bandes sont lyophilisées et stockées dans une bouteille sombre hermétiquement fermée avec un bouchon à vis.
3. pour l’utilisation, une bande est retirée, déposée dans une boîte de Pétri et humidifiée avec de l’eau distillée.,
4. La Colonie à tester est ramassée avec une boucle de platine et étalée sur la zone humide.
5. une réaction positive est indiquée par une teinte pourpre foncé intense, apparaissant en 5 à 10 Secondes, une réaction « positive retardée” par coloration en 10 à 60 secondes et une réaction négative par absence de coloration ou par coloration postérieure à 60 secondes.

méthode du papier filtre humide

1. Une bande de papier filtre est imbibée d’un peu de solution fraîchement préparée à 1% du réactif.
2. Un grain de culture est frotté dessus avec une boucle de platine.,
3. une réaction positive est indiquée par une teinte pourpre foncé intense, apparaissant en 5 à 10 Secondes, une réaction « positive retardée” par coloration en 10 à 60 secondes et une réaction négative par absence de coloration ou par coloration postérieure à 60 secondes.

méthode sur plaque directe

1. ajouter 2 à 3 gouttes de réactif directement aux colonies suspectes sur une plaque de gélose. Ne pas inonder la plaque avec le réactif.
2. Observez le changement de couleur dans les 10 Secondes.

Remarque: la méthode de la plaque directe doit être effectuée sur une plaque de gélose non sélective.,

1. lors de l’utilisation du réactif oxydase de Kovac, les microorganismes sont oxydases positives lorsque la couleur passe au violet foncé dans les 5 à 10 Secondes. Les microorganismes sont retardés oxydase positive lorsque la couleur passe au violet dans les 60 à 90 secondes. Les microorganismes sont oxydases négatives si la couleur ne change pas ou si cela prend plus de 2 minutes.
2. lors de l’utilisation du réactif Gordon et McLeod, les microorganismes sont oxydase positive lorsque la couleur passe au rouge dans les 10 à 30 minutes ou au noir dans les 60 minutes. Les microorganismes sont oxydases négatives si la couleur ne change pas.,

méthode D’écouvillon

1. tremper l’écouvillon dans le réactif, puis toucher une colonie suspecte isolée
2. observer le changement de couleur dans les 10 Secondes.

méthode en Tube à essai

1. cultiver une culture fraîche (18 à 24 heures) de bactéries dans 4,5 ml de bouillon nutritif (ou un milieu standard qui ne contient pas une forte concentration de sucre).
2. Ajouter 0,2 ml d’α-naphtol à 1%, puis Ajouter 0,3 ml d’oxalate de p-aminodiméthylaniline à 1% (réactifs Gaby et Hadley).
3. agiter vigoureusement pour assurer le mélange et l’oxygénation complète de la culture.,
4. observez les changements de couleur.
5. Les microorganismes sont oxydases positives lorsque la couleur devient bleue en 15 à 30 secondes. Les microorganismes sont retardés oxydase positive lorsque la couleur passe au violet dans les 2 à 3 minutes. Les microorganismes sont oxydases négatives si la couleur ne change pas.

interprétation du résultat du Test D’oxydase

résultat positif

Le développement d’une couleur bleu-violet foncé / bleu indique la production d’oxydase en 5 à 10 Secondes.

Résultat Négatif

Pas de bleu-violet couleur/Pas de changement de couleur.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

contrôle de la qualité pour le Test D’oxydase

contrôle positif: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

contrôle négatif: Escherichia coli ATCC 25922

limites du Test D’oxydase

1. Les réactifs utilisés dans le test d’oxydase se sont auto-oxydés, il est donc très important d’utiliser des réactifs frais, pas plus de 1 semaine.
2. Les bactéries et les levures cultivées sur des milieux contenant de fortes concentrations de glucose montrent une activité oxydase inhibée, il est donc recommandé de tester les colonies cultivées sur des milieux sans excès de sucre, telles que la gélose nutritive., La gélose de soja tryptique est également un excellent milieu.
3. les Bactéries cultivées sur des milieux contenant des colorants peuvent donner des résultats aberrants.
4. Les réactifs d’essai tueront efficacement les micro-organismes, de sorte que la sous-culture doit être effectuée avant d’ajouter un réactif à une culture active.
5. Le test d’oxydase peut être utilisé dans l’identification présumée de Neisseria et dans la différenciation et l’identification des bacilles à gram négatif. Les organismes à oxydase positive doivent être examinés par coloration de gram pour déterminer la morphologie et la réaction de gram., Des tests biochimiques supplémentaires sont recommandés pour une identification complète.
6. L’utilisation d’un nichrome ou d’une autre boucle contenant du fer peut entraîner des réactions faussement positives. Les boucles en platine sont recommandées.
7. La Plupart Des Haemophilus sont oxydases positives. Des bandes ou des réactifs moins sensibles peuvent donner des résultats faussement négatifs.
8. Les réactions Oxydasiques des bacilles à gram négatif doivent être déterminées sur des milieux non sélectifs et non différentiels pour garantir des résultats valides. En outre, les colonies prélevées dans des milieux contenant des niveaux élevés de glucose peuvent donner des réactions faussement négatives.,
9. Il est recommandé d’utiliser des colonies âgées de 18 à 24 heures. Les colonies plus âgées produiront des réactions plus faibles.
10. tout changement de couleur apparaissant après 20 secondes doit être ignoré.