Les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont commencé à apparaître dans la littérature au milieu des années 2000 et ont eu un effet transformateur sur notre compréhension de la génomique microbienne et des maladies infectieuses. Il existe néanmoins une controverse considérable sur comment, quand et où le séquençage de la prochaine génération jouera un rôle dans le laboratoire de diagnostic clinique., Une discussion approfondie point-contrepoint du Journal of Clinical Microbiology examine les défis et les opportunités qui peuvent découler de l’introduction du séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) dans les laboratoires de routine. Qu’est-ce que mNGS exactement et en quoi est-il différent des nombreuses autres technologies d’acide nucléique là-bas?

qu’est-ce que le séquençage métagénomique de nouvelle génération?

le séquençage de nouvelle génération est l’une des nombreuses méthodes de séquençage à haut débit permettant de séquencer simultanément et indépendamment des milliards de fragments d’acide nucléique., Comparez cette technique aux méthodes classiques telles que le séquençage Sanger (également connu sous le nom de séquençage de terminaison de chaîne didésoxynucléotidique), qui traite une séquence nucléotidique par réaction.
pour caractériser un génome bactérien à L’aide de NGS, par exemple, le génome est divisé en plusieurs fragments qui produisent des séquences ou des lectures allant de centaines à des dizaines de milliers de bases de longueur. Les séquences sont assemblées en un seul génome à l’aide d’approches informatiques. Plusieurs lectures de séquence qui se chevauchent sont reconstituées pour produire une seule séquence plus longue appelée contig., Il y a souvent des écarts entre les contigs et bien que des lectures de séquence plus longues haute fidélité soient la méthode idéale de séquençage, les plates-formes qui produisent des lectures plus courtes sont généralement moins coûteuses et le chevauchement des séquences les rend plus précises. Le génome construit (contenant probablement des lacunes) est aligné sur une base de données de référence pour l’identification de l’organisme. Cette technologie représente une avancée substantielle par rapport aux premiers jours du séquençage, alors qu’un seul projet de génome bactérien pourrait prendre plusieurs années.,
Metagenomic NGS (mNGS) est simplement en cours d’exécution tous les acides nucléiques dans un échantillon, qui peut contenir des populations mixtes de micro-organismes, et en les assignant à leurs génomes de référence pour comprendre quels microbes sont présents et dans quelles proportions. La capacité de séquencer et d’identifier les acides nucléiques de plusieurs taxons différents pour l’analyse métagénomique en fait une nouvelle plate-forme puissante qui peut simultanément identifier du matériel génétique provenant de règnes d’organismes entièrement différents.,

Les applications cliniques possibles sont énormes, y compris le diagnostic des maladies infectieuses, le suivi des éclosions, la surveillance du contrôle des infections et la découverte de mutations et d’agents pathogènes, entre autres. mNGS, parfois appelé séquençage de fusil de chasse, des échantillons cliniques a été appliqué à divers types d’échantillons, y compris le liquide céphalo-rachidien, le sang, les échantillons respiratoires, le liquide gastro-intestinal et le liquide oculaire.

Quels sont les avantages du séquençage métagénomique de nouvelle génération?,

la plus grande force des mNGS est qu’il s’agit d’une méthode de diagnostic impartiale sans hypothèse, contrairement aux méthodes de réaction en chaîne par polymérase ciblée (PCR) qui reposent sur des amorces pour l’identification de cibles spécifiques à amplifier et à détecter. Même les méthodes de PCR universelles ou à large portée ne sont pas suffisamment larges pour être considérées comme métagénomiques, car elles utilisent des amorces spécifiques du gène de L’ARN ribosomique 16S conservé (ARNr) et des séquences d’espaceurs transcrits internes (ITS) pour amplifier des séquences d’acides nucléiques distinctives qui peuvent être classifiées bioinformatiquement en bactéries/archées ou champignons respectivement.,
Les amorces universelles posent également un problème lors du diagnostic des infections polymicrobiennes avec des tests moléculaires. Si des populations polymicrobiennes sont présentes lors de l’utilisation du séquençage 16S, plusieurs appels de base seront effectués par nucléotide, produisant un chromatogramme nucléotidique mixte qui ne peut pas être interprété. Bien qu’il existe des méthodes de calcul dé-convolutionnelles disponibles pour prédire les organismes identifiés, celles-ci ne sont pas utilisées de manière standard pour de nombreux laboratoires, qui réfléchissent souvent au séquençage de prochaine génération du gène 16S pour les échantillons polymicrobiens.,

Quels sont les défis du séquençage métagénomique de nouvelle génération?

malgré le potentiel des MNG, il existe de nombreux obstacles à éliminer avant que la technologie puisse faire partie du laboratoire principal, ainsi que des lacunes dans notre compréhension de son utilité diagnostique. Les principales réserves portent sur l’interprétation des résultats (distinguer la contamination et la colonisation des agents pathogènes véritables), la sélection et la validation des bases de données utilisées pour les analyses et la prédiction (ou l’absence de celles-ci) des susceptibilités aux antimicrobiens., Une perception commune est que mNGS est si incroyablement sensible qu’il révélera un diagnostic lorsque tous les autres tests sont négatifs. Bien que les MNG puissent être analytiquement plus sensibles que les méthodes de culture standard dans certains cas, l’élimination nécessaire de grandes quantités d’acide nucléique humain pendant la préparation du séquençage et (par des méthodes de calcul) pendant le processus post-analytique peut diminuer la sensibilité par rapport aux approches PCR ciblées pour de nombreux organismes.
la spécificité des mNGS reste l’éléphant proverbial dans la pièce., La Contamination des échantillons pendant la collecte des échantillons est une grande préoccupation étant donné la sensibilité analytique accrue des MNG par rapport aux méthodes de culture standard, et il doit y avoir un processus de contrôle de la qualité validé en place pour les étapes allant de l’évaluation de la pureté du réactif à la mesure des contrôles adéquats de la couverture génomique. En outre, avec certaines plates-formes Illumina, les mauvais indices de codes-barres peuvent être désignés, conduisant à des faux positifs sur les données de séquençage., Des contrôles de qualité bioinformatiques sont nécessaires pour s’assurer que des génomes de haute qualité et validés sont disponibles avec un minimum d’erreurs de base de données et il y aurait idéalement du personnel bioinformatique disponible pour interpréter les résultats de séquençage pour chaque test, ce qui n’est pas disponible dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique., La Federal Drug Administration (FDA) a collaboré avec d’autres agences fédérales pour organiser une base de données intitulée FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), qui a été utile pour s’assurer que les résultats actuels de mNGS sont fiables et précis, mais ces ressources doivent être mises à jour et maintenues.

la plus grande question demeure autour de la spécificité clinique de mNGS: les séquences détectées à partir de pathogènes qui contribuent à la maladie actuelle du patient?, La spécificité analytique des tests mNGS peut être abordée avec des contrôles rigoureux tout au long de la collecte des échantillons, de la préparation de la bibliothèque de séquençage, de l’exécution des tests et de la classification bioinformatique, mais la spécificité clinique n’est pas directement abordée par ces approches. Les Questions qui peuvent aider à déterminer l’utilité clinique et l’applicabilité comprennent: Comment Pouvons-nous distinguer les organismes liés à la bactériémie transitoire de la flore buccale/gastro-intestinale ou des colonisateurs cutanés dans le sang/plasma mNGS test?, Comment la profondeur de séquençage doit-elle être rapportée et quelle est la fiabilité de la relation entre la profondeur de séquence et la véritable infection? Cette relation diffère-t-elle selon l’agent pathogène/hôte? Combien de temps la demi-vie détectable attendue d’un agent pathogène par mNGS une fois que le patient reçoit un traitement curatif approprié? Des études sur l’utilité clinique et la rentabilité sont grandement nécessaires malgré la puissance incontestable de cette technologie du point de vue de la recherche et de la découverte.,
Il est également intéressant de souligner qu’il n’y a pas de tests mNGS actuellement approuvés par la FDA ou approuvés qui peuvent être envoyés pour des tests microbiens, bien qu’il existe des laboratoires certifiés en vertu des amendements D’amélioration des Laboratoires Cliniques de 1988 (CLIA ’88) qui offrent des tests sur des échantillons cliniques. À ce jour, seuls quelques systèmes de diagnostic NGS ont été autorisés par la FDA pour les tests oncologiques ou la détection de la fibrose kystique, par exemple., Un examen récent décrit en détail de nombreux obstacles et considérations réglementaires qui devront être abordés avant que les MNG puissent entrer dans les laboratoires de diagnostic clinique traditionnels en tant que test validé par la FDA.
En résumé, bien que les tests mNGS puissent probablement jouer un rôle majeur dans le flux de travail de diagnostic microbiologique à l’avenir, en particulier à mesure que le séquençage et la puissance de traitement bioinformatique évoluent, cela reste une technologie très complexe pour laquelle l’utilité clinique dans notre environnement de pratique médicale actuel reste incertaine., Bien que les tests mNGS puissent offrir des opportunités cliniques diagnostiques nouvelles et passionnantes dans un proche avenir, aucun d’entre eux ne remplacera probablement un clinicien astucieux de sitôt.