Les connexions génétiques entre les voies de réparation de l’ADN et la prédisposition au cancer humain ont alimenté l’intérêt pour les protéines qui reconnaissent et réparent des sites Les enzymes de réparation sont remarquablement conservées des bactéries aux champignons en passant par les humains, ce qui souligne la prime accordée au maintien de l’intégrité génomique face à un fardeau mutagène., L’ADN est sensible aux dommages causés par des erreurs commises pendant la réplication et par des facteurs environnementaux, tels que le rayonnement, les oxydants ou les agents alkylants. Les réactions de réparation impliquent l’excision de bases chimiquement altérées ou mal appariées du duplex D’ADN. Les lacunes résultantes sont comblées par des ADN polymérases; cette réaction laisse une entaille à ou flanquant le site de réparation. Un processus analogue se produit pendant la réplication de l’ADN chromosomique, par lequel les segments D’ARN 5’qui amorcent la synthèse discontinue des fragments D’Okazaki sont excisés, et les lacunes intermédiaires sont comblées par L’ADN polymérase.,

Les voies de réparation et de réplication de L’ADN convergent vers une étape finale commune dans laquelle la continuité du brin d’ADN réparé est restaurée par L’ADN ligase, une enzyme qui convertit les entailles en liaisons phosphodiester. Les entailles sont des lésions potentiellement délétères de l’ADN qui, si elles ne sont pas corrigées, peuvent donner lieu à des ruptures mortelles à double brin. En conséquence, la perte totale de la fonction de L’ADN ligase est létale.

réaction de L’ADN Ligase

Les ADN ligases catalysent la jonction d’un brin terminé par 5’phosphate à un brin terminé par 3’hydroxyle., La ligature dépend du magnésium et d’un cofacteur à haute énergie, ATP ou NAD+. Le mécanisme réactionnel implique 3 réactions séquentielles de transfert nucléotidyle. Dans la première étape, l’attaque nucléophile sur l’alpha-phosphore de L’ATP (adénosine triphosphate) ou du NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide) par la ligase entraîne la libération de pyrophosphate ou de NMN (nicotinamide mononucléotide) et la formation d’un intermédiaire covalent (ligase-adénylate) dans lequel L’AMP est liée via une liaison phosphoamide (P-N) au groupe epsilon-amino d’une lysine., Dans la deuxième étape, L’AMP est transféré à l’extrémité 5’du brin d’ADN terminé par 5’phosphate pour former de L’ADN-adénylate-une structure de pont pyrophosphate inversée, AppN. Dans cette réaction, l’oxygène 5 ‘ – phosphate du brin D’ADN attaque le phosphore de la ligase-adénylate; la chaîne latérale lysine du site actif est le groupe partant. Dans la troisième étape, la ligase catalyse l’attaque par le 3’-OH du nick sur L’ADN-adénylate pour rejoindre les 2 polynucléotides et libérer L’AMP.

Distribution phylogénétique

Les organismes vivants comprennent 3 Domaines: les eubactéries, les archéabactéries et les eucaryotes., Tous les organismes codent 1 ou plusieurs ADN ligases. Les ligases sont regroupées en 2 familles, les ligases ATP-dépendantes et les ligases NAD + -dépendantes, selon le substrat nucléotidique requis pour la formation de ligase-adénylate. Les ADN ligases ATP-dépendantes se trouvent dans les 3 domaines. Les ADN ligases NAD + – dépendantes (LigA) sont omniprésentes dans les bactéries, où elles sont essentielles à la croissance et présentent des cibles attrayantes pour la découverte de médicaments anti-infectieux. Les ligases NAD + – dépendantes ne sont rencontrées que sporadiquement en dehors du domaine bactérien de la vie, par exemple,, chez les archées Halophiles et certains virus à ADN, et ont vraisemblablement été acquis chez ces taxons par transfert horizontal de gènes.

Ligases dépendantes de L’ATP cellulaires eucaryotes

Les ADN ligases dépendantes de l’ATP se trouvent chez toutes les espèces eucaryotes. Les cellules de mammifères contiennent quatre isozymes D’ADN ligase. Les comparaisons de séquences d’acides aminés suggèrent qu’un domaine catalytique central commun à toutes les ligases dépendantes de L’ATP est agrémenté de domaines spécifiques aux isozymes supplémentaires situés aux termini amino ou carboxyle des protéines., On pense que ces segments flanquants médient la liaison des ADN ligases de mammifères à d’autres protéines impliquées dans la réplication, la réparation et la recombinaison de l’ADN. Les isozymes de mammifères sont appelées ligase I, ligase IIIa, ligase IIIb et ligase IV. L’ADN ligase I est un polypeptide à 919 acides aminés, exprimé dans tous les tissus, qui catalyse la jonction des fragments D’Okazaki pendant la réplication de l’ADN et joue également un rôle dans la réparation de l’ADN., Les ADN ligases IIIa (922 acides aminés) et IIIb (862 acides aminés) sont les produits d’un seul gène; elles ne diffèrent dans la séquence des acides aminés qu’à leur Termini carboxyle en raison de l’épissage alternatif de l’ARNm. La Ligase IIIa est exprimée de manière ubiquitaire et est impliquée dans la réparation de l’ADN et est essentielle pour la fonction mitochondriale. L’expression de la Ligase IIIb est limitée au testicule, plus précisément aux spermatocytes subissant une méiose. L’ADN ligase IV est un polypeptide d’acide aminé 911 qui joue un rôle dans la réparation des ruptures D’ADN double brin par l’intermédiaire de l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ).,

Les cellules de levure contiennent 2 ADN ligases codées séparément, qui sont homologues aux ADN ligases I et IV de mammifères, respectivement. L’ADN ligase I (Cdc9p) de la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae est essentielle à la croissance cellulaire. Des expériences génétiques impliquent la ligase I dans l’étanchéité des fragments D’Okazaki et dans l’achèvement de la réparation de l’excision de l’ADN. En revanche, l’ADN ligase IV de levure N’est pas essentiel à la croissance cellulaire. Cependant, la délétion du gène LIG4 provoque des phénotypes indiquant que la ligase IV catalyse la réparation des ruptures à double brin dans la voie de jonction des extrémités non homologues (NHEJ)., Les levures bourgeonnantes n’ont pas d’homologue apparent de l’ADN ligase III des mammifères.

ADN ligases dépendantes de L’ATP virales

les virus de L’ADN bactérien, tels que les bactériophages D’E. coli T4, T6, T7 et T3, codent leurs propres ADN ligases dépendantes de l’ATP. Les ADN ligases ATP-dépendantes sont également codées par des virus à ADN eucaryotes qui effectuent une partie ou la totalité de leur cycle de réplication dans le cytoplasme. Il s’agit notamment du virus de la vaccine, du virus de la peste porcine africaine et du virus de la Chlorella PBCV1. Les ligases bactériophages et les ADN viraux eucaryotes sont plus petites que leurs homologues cellulaires., L’ADN ligase de la vaccine, un polypeptide de 552 acides aminés, est étonnamment similaire au niveau de la séquence d’acides aminés à L’ADN ligase III des mammifères. en effet, la ligase III est plus étroitement liée à la ligase de la vaccine qu’aux ligases I et IV des mammifères.les ligases de T4 (487 acides aminés), T7 (359 acides aminés), T3 (346 acides aminés) et du virus de la Chlorelle (298 acides aminés) sont encore plus petites. Nous avons montré que le virus Chlorella ligase peut compléter la croissance d’une souche de levure dans laquelle le gène de L’ADN ligase I a été supprimé., Ce résultat suggère que les segments de protéines uniques à L’ADN ligase I, beaucoup plus grande, ne sont pas essentiels à la croissance des cellules de levure.

détection de Nick par les ADN Ligases

Nous avons examiné l’interaction des ligases eucaryotes avec L’ADN en utilisant des enzymes codées par des virus comme modèles. L’ADN ligase du virus de la vaccine et L’ADN ligase du virus de la Chlorella forment chacun un complexe discret avec un ligand d’ADN unique entaillé en l’absence de magnésium qui peut être résolu à partir de L’ADN libre par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif., Les ligases virales ne forment pas de complexes stables avec les ligands suivants: (i) L’ADN contenant un espace nucléotidique 1 ou nucléotidique 2; (ii) le produit d’ADN duplex scellé de la réaction de ligature; (iii) un duplex isolé contenant une extrémité 5’-OH au niveau de l’entaille au lieu d’un phosphate 5’; ou (iv) Un duplex isolé contenant un brin D’ARN du côté 5’-phosphate de l’entaille (10 à 15). Ainsi, les ADN ligases dépendantes de l’ATP virales ont une fonction intrinsèque de détection de nick.,

la reconnaissance du Nick par l’ADN ligase de la vaccine et L’ADN ligase du virus de la Chlorella dépend également de l’occupation de la poche de liaison de L’AMP sur l’enzyme — c’est-à-dire que les mutations du site actif de la ligase qui abolissent la capacité de former l’intermédiaire ligase-adénylate éliminent également la reconnaissance du nick; alors qu’une mutation qui préserve la formation de la ligase-adénylate mais inactive les étapes en aval de la réaction de jonction des brins n’a aucun effet sur la liaison à l’ADN entaillé., La séquestration d’un nucléotide extrahélique par une ligase liée à L’ADN rappelle le mécanisme de « retournement de base” de la reconnaissance du site cible et de la catalyse utilisé par d’autres enzymes de modification et de réparation de l’ADN.

bien que la fraction 5’-phosphate soit essentielle pour la liaison de la Chlorella virus ligase à L’ADN entaillé, la fraction 3’-OH n’est pas nécessaire pour la reconnaissance des entailles. La Chlorella virus ligase se lie à un ligand entaillé contenant 2’, 3’ didéoxy et 5’-phosphate termini mais ne peut pas catalyser l’adénylation de l’extrémité 5’., Ainsi, le 3 ‘ – OH est important pour la chimie de l’étape 2 même s’il n’est pas lui-même chimiquement transformé lors de la formation D’ADN-adénylate.

pour délimiter l’interface ligase-ADN, nous avons imprimé le site de liaison de la ligase sur L’ADN. La taille de l’empreinte exonucléase III de la ligase liée à un seul nick dans L’ADN duplex est de 19 à 21 nucléotides. L’empreinte est asymétrique, s’étendant de 8 à 9 nucléotides du côté 3’-OH du nick et de 11 à 12 nucléotides du côté 5’-phosphate.,

structure cristalline de L’ADN ligase-adénylate eucaryote

L’ADN ligase du virus Chlorella (ChVLig) est la plus petite ligase eucaryote ATP-dépendante connue. En tant que ligase D’ADN” minimale », elle présentait une cible attrayante pour la détermination de la structure. Nous avons cristallisé ChVLig et déterminé sa structure à une résolution de 2 Å. L’enzyme se compose d’un domaine n-terminal nucléotidyltransférase (NTase) plus grand et d’un domaine OB C-terminal plus petit avec une fente entre eux. Une fraction D’AMP a été liée de manière covalente à Nz de Lys27 au site actif., Ainsi, nous avons la structure d’un véritable catalyseur intermédiaire.

dans le domaine NTase se trouve une poche de liaison à l’adénylate composée des six motifs peptidiques (I, Ia, III, IIIa, IV et V) qui définissent la superfamille des enzymes nucléotidyltransférases covalentes qui comprend les ligases D’ADN et D’ARN et les enzymes de capsulage de l’ARNm. Le Motif I (KxDGxR) contient la lysine à laquelle L’AMP devient liée de manière covalente dans la première étape de la réaction de la ligase. Les acides aminés des motifs Ia, III, IIIa, IV et V entrent en contact avec L’AMP et jouent un rôle essentiel dans une ou plusieurs étapes de la voie de ligature., Le domaine OB se compose d’un baril bêta antiparallèle à cinq brins plus une hélice alpha.

base structurale de la reconnaissance des Nick par une ADN ligase « pluripotente” minimale

bien que le ChVLig ne possède pas les grands domaines latéraux N – ou C-terminaux que l’on trouve dans les ADN ligases cellulaires eucaryotes, il peut soutenir la croissance mitotique, la réparation de l’ADN et la jonction des extrémités non homologues dans la levure en herbe lorsqu’il est la seule source de ligase dans la cellule. ChVLig peut même remplir les fonctions essentielles de lig3 mammalien dans le métabolisme de L’ADN mitochondrial., Nous avons proposé que ChVLig représente une ligase « pluripotente” dépouillée en raison de sa fonction intrinsèque de détection de nick, dont la base a été éclairée lorsque nous avons résolu la structure cristalline de 2,3 Å de ChVLig-AMP lié à un nick 3’-OH/5’-PO4 dans L’ADN duplex.

ChVLig encercle l’ADN sous la forme d’une pince protéique en forme de C. Le domaine NTase se lie aux brins d’ADN cassés et intacts dans la rainure majeure flanquant le nick et aussi dans la rainure mineure du côté 3’-OH du nick. Le domaine OB se lie à travers la rainure mineure sur la face du duplex derrière le nick., Un nouveau module « loquet » -constitué d’une boucle en épingle bêta émanant du domaine OB – occupe la rainure principale et complète la pince circonférentielle via des contacts entre la pointe de la boucle et la surface du domaine NTase. Le loquet est essentiel pour la fermeture de la pince et est un déterminant clé de la détection de nick.

la comparaison des structures cristallines du chvlig-AMP libre et lié au nick révèle un grand réarrangements de domaine accompagnant la reconnaissance du nick., Dans le ChVLig-AMP libre, le domaine D’OB est réfléchi loin du domaine de NTase pour exposer complètement la surface ADN-obligatoire au-dessus de la poche AMP-obligatoire. Le segment peptidique destiné à devenir le verrou est désordonné dans la ligase libre et sensible à la protéolyse. Mais ce segment est protégé contre la protéolyse lorsque ChVLig se lie à L’ADN entaillé. La liaison à L’ADN entraîne une rotation de près de 180 du domaine OB autour d’un pivot, de sorte que la surface concave du canon bêta OB s’insère dans la rainure mineure de l’ADN., Cette transition provoque un mouvement de 63 Å du domaine OB et place le verrou profondément dans le sillon majeur de L’ADN.

un réseau d’interactions avec les termini 3’-OH et 5’-PO4 dans le site actif a éclairé le mécanisme d’adénylylation de l’ADN et les rôles critiques de L’AMP dans la détection de nick et la catalyse. L’Addition d’un cation divalent a déclenché le scellement de nick dans crystallo, établissant ainsi que le complexe de nick est un intermédiaire de bonne foi dans la voie de réparation de l’ADN.,

Structure de L’ADN Ligase dépendant du NAD+lié à L’ADN-adénylate entaillé

Les ADN ligases dépendantes du nad+(appelées LigA) sont un clade distinctif et structurellement homogène d’enzymes que l’on trouve chez toutes les bactéries. E. coli LigA (671-aa) est le prototype de cette famille. LigA a une architecture modulaire construite autour d’un noyau ligase central composé d’un domaine NTase et D’un domaine OB. Le noyau est flanqué d’un domaine N-terminal « Ia” et de trois modules C-terminaux: un doigt de zinc tétracystéine, un domaine helix-hairpin-helix (HHH) et un domaine BRCT., Chaque étape de la voie de ligature dépend d’un sous-ensemble différent des domaines LigA, seul le domaine NTase étant requis pour toutes les étapes. Le domaine Ia est unique aux ligases dépendantes du NAD+, est responsable de la liaison de la fraction NMN du NAD+ et est requis pour que la réaction avec le NAD+ forme l’intermédiaire ligase-AMP.

Nous avons constaté que L’ADN ligase d’E. coli dépendant du NAD+peut soutenir la croissance de souches de Saccharomyces cerevisiae supprimées individuellement pour CDC9 ou doublement pour CDC9 plus LIG4., Il s’agit de la première démonstration qu’une enzyme dépendante du NAD+est biologiquement active dans un organisme eucaryote. Des études ultérieures (en collaboration avec Maria Jasin) ont montré que E. coli LigA pouvait suffire pour la fonction ligase dans les cellules ES de souris dépourvues de L’enzyme essentielle Lig3.

notre structure cristalline de E. coli LigA liée à L’intermédiaire ADN-adénylate entaillé a révélé que LigA encercle également l’hélice D’ADN en tant que pince protéique en forme de C. L’interface protéine-ADN implique des contacts D’ADN étendus par les domaines NTase, OB et HhH sur un segment de 19 bp d’ADN duplex centré autour du nick., Le domaine de NTase lie aux brins cassés D’ADN et flanquant l’entaille, le domaine D’OB entre en contact avec le brin continu de modèle entourant l’entaille, et le domaine de HhH lie les deux brins à travers la cannelure mineure à la périphérie de l’empreinte. Le module Zn-finger joue un rôle structurel dans le pontage des domaines OB et HhH. Le domaine Ia n’établit aucun contact avec le duplex D’ADN, compatible avec sa dispensabilité pour la catalyse de la fermeture de brin sur un substrat AppDNA.,

les domaines LigA NTase et OB sont positionnés de manière similaire sur la circonférence de l’ADN aux domaines NTase et OB des ADN ligases dépendantes de L’ATP, et ils « empreinte” des segments similaires des brins D’ADN. Pourtant, la topologie de la pince LigA est très différente des pinces formées par ChVLig et l’ADN ligase humaine 1 (HuLig1, déterminé par Tom Ellenberger et ses collègues). Les contacts embrassant qui ferment la pince LigA sont sui generis, impliquant le domaine NTase et le domaine C-terminal HhH., Sur la base des données structurelles disponibles, il est clair que les ADN ligases ont évolué au moins trois moyens différents d’encercler L’ADN.

Les comparaisons du complexe E. coli LigA—AppDNA avec des structures d’autres ligases bactériennes capturées comme le complexe binaire LigA•—NAD+ (substrat de l’étape 1), Le complexe binaire LigA•—NMN (groupe sortant après l’étape 1) et l’intermédiaire ligase-AMP covalente (produit de l’étape 1 après dissociation du groupe) mettent en évidence des réarrangements massifs de domaines protéiques (de l’ordre de 50 à 90 Å) qui se produisent en synchronisation avec la liaison au substrat et la catalyse., La liaison de L’ADN et la formation de la pince par LigA entraînent une rotation de près de 180 du domaine OB de sorte que la surface concave du canon bêta OB s’insère dans la rainure mineure, similaire à ce qui est vu ou déduit pour ChVLig et HuLig1. La liaison en quatre points du domaine HhH à la périphérie de L’empreinte LigA-ADN stabilise une courbure de L’ADN centrée sur le nick. Les interactions LigA-ADN qui flanquent immédiatement le nick induisent une distorsion locale de l’ADN, entraînant l’adoption d’une hélice de forme A semblable à L’ARN, faisant à nouveau écho aux résultats pour le cocrystal D’ADN HuLig1.,

mécanisme de l’adénylylation de la lysine par des polynucléotides ligases dépendantes de l’ATP et de la NAD+

la réaction d’auto-adénylylation des polynucléotides ligases est réalisée par un domaine nucléotidyltransférase (NTase) qui est conservé dans des ADN et des ARN ligases dépendantes de l’ATP et des ADN ligases dépendantes de la NAD+. Le domaine NTase comprend la définition de motifs peptidiques qui forment la poche de liaison aux nucléotides. Motif I (KxDG) contient la lysine qui se fixe de manière covalente à L’AMP. Comme Robert Lehman l’a souligné en 1974, on ne sait pas comment la lysine (avec une valeur de pKa prédite de ~10.,5) perd son proton au pH physiologique pour atteindre l’état non protégé requis pour attaquer le phosphore α De L’ATP ou du nad+. En principe, la ligase pourrait utiliser une base générale pour déprotoner la lysine. Alternativement, le pKa pourrait être entraîné vers le bas par le potentiel de charge positif des acides aminés protéiques entourant la lysine-Nz. Plusieurs structures cristallines de ligases de métaux absents ont fourni peu de support pour l’une ou l’autre explication. Dans ces structures, le nucléophile de lysine motif I est situé à côté d’une chaîne latérale de glutamate ou d’aspartate motif IV., La lysine et le carboxylate motif IV forment une paire d’ions, dont l’effet prévu est d’augmenter le pKa de la lysine en vertu de la charge négative environnante. Il est peu probable qu’un anion glutamate ou aspartate puisse servir de base générale pour extraire un proton du cation lysine. Une solution potentielle au problème serait si un cation divalent vient en appui sur la lysine-Nz et entraîne son pKa.,

une structure cristalline récente de Naegleria gruberi ARN ligase (NgrRnl) a révélé un mécanisme à entraînement métallique en tant que complexe de Michaelis de l’étape 1 avec de l’ATP et du manganèse (son cofacteur métallique préféré). La clé pour capturer le complexe de type Michaelis était le remplacement du nucléophile de la lysine par une méthionine isostérique. La structure de 1,9 Å contenait de l’ATP et deux ions manganèse dans le site actif. Le métal « catalytique » a été coordonné avec la géométrie octaédrique à cinq eaux, qui ont été à leur tour coordonnées par les chaînes latérales carboxylates des résidus conservés dans les motifs I, III et IV., Le sixième site de ligand dans le complexe métallique catalytique était occupé par un oxygène ATP α phosphate, ce qui indique un rôle pour le métal dans la stabilisation de l’état de transition de la réaction d’auto-adénylylation. Un aperçu clé, enrichi par la superposition du complexe de Michaelis sur la structure de l’intermédiaire covalent NGRRNL-(Lys-Nz)–AMP, concernait le rôle du complexe métallique catalytique dans la stabilisation de l’état non protoné du nucléophile de la lysine avant la catalyse, via une charge positive locale et le contact atomique de Lys-NZ avec l’une des eaux liées au métal., Le complexe de Ngrrnl Michaelis a révélé un deuxième métal, coordonné octaédralement à quatre eaux et à L’ATP β Et γ phosphate oxygènes. Le complexe métallique et L’ATP γ phosphate ont été engagés par un ensemble de chaînes latérales d’acides aminés (uniques à NgrRnl) qui orientent collectivement le groupe PPI laissant apical au nucléophile lysine. Conformément à un mécanisme en ligne à une seule étape, le phosphate α a été inversé stéréochimiquement pendant la transition du complexe NGRRNL•ATP Michaelis à l’intermédiaire lysyl-AMP.,

on pense que les ADN ligases ont évolué séparément des ARN ligases, initialement par fusion d’un domaine ntase ancestral utilisant L’ATP en un domaine OB C-terminal (pour comprendre le noyau catalytique minimal d’une ADN ligase), puis par fusion de modules structurels supplémentaires au noyau NTase-OB (7). Les ADN ligases dépendantes du NAD + (enzymes LigA), qui sont omniprésentes dans les bactéries et essentielles à la viabilité bactérienne, ont acquis leur spécificité pour le NAD+ via la fusion d’un module de domaine Ia liant le NMN à l’extrémité N du domaine NTase., L’ADN ligase d’Escherichia coli (EcoLigA) a été la première ADN ligase cellulaire découverte et caractérisée et reste le premier modèle pour les études structurelles et fonctionnelles de la famille D’ADN ligase dépendante du NAD+. L’intérêt pour le mécanisme LigA est propulsé par la promesse de cibler LigA (via sa spécificité de substrat nad+ et ses caractéristiques structurelles uniques vis-à-vis des ligases d’ADN humain) pour la découverte de médicaments antibactériens.

nous avons résolu une structure cristalline de 1,55 Å D’EcoLigA en tant que complexe de Michaelis avec du nad+ et du magnésium., La structure révèle un mécanisme à un métal dans lequel un complexe Mg2+(H2O)5 lié à la ligase abaisse la pKa de la lysine et engage le phosphate α nad+, mais le phosphate β et le nucléoside nicotinamide du groupe sortant NMN sont orientés uniquement via des interactions atomiques avec des éléments protéiques uniques au clade LigA. La dichotomie entre deux métaux (pour la ligase dépendante de l’ATP) et un métal (pour la ligase dépendante du NAD+) délimite un point de branchement dans l’évolution de la ligase.