Après avoir étudié à la RADA de 1992 à 1995, Macfadyen s’est fait connaître dans le théâtre britannique principalement pour son travail avec la compagnie Cheek by Jowl, pour laquelle il a joué Antonio dans The Duchess of Malfi, Charles Surface dans The School for Scandal et Benedick dans Much Ado About Nothing. Son Benedick a été joué comme un bouffon de classe d’officier avec une moustache et un rire braisant. En 2005, il joue le Prince Hal dans Henry IV, première et deuxième parties au Royal National Theatre, avec Michael Gambon dans le rôle de Falstaff., En 2007, il revient sur scène en interprétant un américain, Clay, un père au foyer à l’attitude libérale dans la pièce the Pain and The Itch.
Une percée télévisuelle s’est produite lorsqu’il est apparu dans le rôle de Hareton Earnshaw dans une adaptation de Wuthering Heights, diffusée sur le réseau ITV en 1998. D’autres dramatiques télévisées ont suivi, y compris des rôles principaux dans les drames Warriors (1999) et The Way We Live Now (2001), tous deux pour la BBC. Toujours en 2001, il a été acclamé pour son rôle principal dans la série dramatique de la BBC Perfect Strangers, qui a été écrite et réalisée par Stephen Poliakoff., En 2002, il a joué dans The Project, un drame de la BBC retraçant L’ascension du New Labour au pouvoir. Il a joué dans Spooks, qui est devenu un succès lors de la projection sur BBC One. Une deuxième saison plus longue a été projetée en 2003, et une troisième saison a été diffusée à l’automne 2004, avec lui quittant la série dans le deuxième épisode. La série a été diffusée en tant que MI-5 sur le réseau A & E. En 2007, il est apparu dans le drame unique de Channel 4 Secret Life, qui traitait du sujet controversé de la pédophilie., Macfadyen a remporté le prix du meilleur acteur aux Royal Television Society 2007 Awards pour ce rôle, et a été nominé pour un BAFTA. Il est également apparu dans un court croquis pour Comic Relief comme le marié dans le mariage de M Bean Bean, aux côtés de Rowan Atkinson et Michelle Ryan.
Buste de M. Darcy joué par Matthew Macfadyen dans Pride& Prejudice (film de 2005)
Macfadyen est apparu dans des films dont Enigma (sorti en 2001), et dans la tanière de mon père, pour lequel il a reçu le New Zealand Screen Award du meilleur acteur., Il a joué le rôle du Romantique Fitzwilliam Darcy dans une adaptation de Pride and Prejudice, sorti au Royaume-Uni en septembre 2005.
Macfadyen a joué dans Death at a Funeral de Frank Oz et le film Incendiary, basé sur le roman de Chris Cleave aux côtés de Michelle Williams et Ewan McGregor. Il est également apparu dans le film Frost/Nixon de Ron Howard, dans lequel il jouait John Birt. En 2008, il a joué le rôle principal masculin Arthur Clennam dans L’adaptation BBC De La Petite Dorrit de Charles Dickens., En 2009, Macfadyen apparaît aux côtés de L’actrice nommée aux Oscars Helena Bonham Carter dans le film BBC Four Enid, basé sur la vie d’Enid Blyton, dans le rôle de Hugh Pollock, éditeur et premier mari de Blyton.
en 2010, il a joué le shérif de Nottingham dans Robin des Bois. Il a joué le rôle de prior Philip dans la série télévisée Les Piliers de la Terre, et était le Logan Mountstuart d’âge moyen dans N’importe quel cœur humain. En juin 2010, Macfadyen a remporté un British Academy Television Award du meilleur acteur dans un second rôle pour son travail dans la Justice pénale.,
en 2011, Macfadyen a fait un dernier caméo dans L’émission de la BBC Spooks, et en 2012, il a joué Oblonsky dans le film de Joe Wright, Anna Karénine. En décembre 2012, il a commencé à interpréter L’Inspecteur Edmund Reid dans Ripper Street DE BBC One.
en 2013-14, il a joué Jeeves dans la production de Jeeves et Wooster in Perfect Nonsense au Duke of York’s Theatre dans le West End de Londres. La pièce a remporté le prix Olivier 2014 de la meilleure nouvelle comédie.
en 2015, Amazon Prime a repris Ripper Street et, après de bonnes critiques, il a été remis en service pour les quatrième et cinquième saisons., Macfadyen a déclaré qu « il était »ravi de se lancer dans une autre dose de Ripper Street – sang et tripes, montres de poche et couvre-chef victorien, merveilleusement sombre, lignes d « histoire émouvantes et mystérieuses de M. Richard Wardlow ». La série a également été diffusée aux États-Unis sur BBC America. Toujours en 2015, il a joué dans l’épisode pilote de The Last Kingdom.
il joue actuellement le rôle de Tom Wambsgans dans la série HBO Succession, pour laquelle il a reçu une nomination aux Primetime Emmy Awards.,
en 2020, il est apparu dans le rôle du Major Charles Ingram dans un drame ITV en trois parties, Quiz, basé sur le scandale controversé de la toux sur Who Wants To Be A Millionaire en 2001.