los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) comenzaron a aparecer en la literatura a mediados de la década de 2000 y tuvieron un efecto transformador en nuestra comprensión de la genómica microbiana y las enfermedades infecciosas. No obstante, existe una considerable controversia sobre cómo, cuándo y dónde la secuenciación de próxima generación desempeñará un papel en el laboratorio de diagnóstico clínico., Una profunda discusión de punto de inmersión-contrapunto del Journal of Clinical Microbiology discute los desafíos y oportunidades que pueden venir con la introducción de la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) en los laboratorios de rutina. ¿Qué es exactamente mNGS y cómo es diferente de las muchas otras tecnologías de ácido nucleico por ahí?

¿Qué es la secuenciación metagenómica de próxima generación?

la secuenciación de próxima generación es cualquiera de varios métodos de secuenciación de alto rendimiento mediante los cuales miles de millones de fragmentos de ácido nucleico pueden secuenciarse de forma simultánea e independiente., Contrasta esta técnica con métodos clásicos como la secuenciación de Sanger (también conocida como secuenciación de terminación de cadena de dideoxinucleótidos), que procesa una secuencia de nucleótidos por reacción.
para caracterizar un genoma bacteriano utilizando NGS, por ejemplo, el genoma se divide en múltiples fragmentos que producen secuencias o lecturas que van desde cientos a decenas de miles de bases de longitud. Las secuencias se ensamblan en un solo genoma utilizando enfoques computacionales. Varias lecturas de secuencia superpuestas se juntan para producir una sola secuencia más larga llamada contig., A menudo hay brechas entre contigs y aunque las lecturas de secuencia más largas de alta fidelidad serían el método ideal de secuenciación, las plataformas que producen lecturas más cortas son generalmente menos costosas y la superposición en las secuencias las hace más precisas. El genoma construido (que probablemente contiene lagunas) está alineado con una base de datos de referencia para la identificación del organismo. Esta tecnología representa un avance sustancial en los primeros días de la secuenciación, cuando un solo proyecto de genoma bacteriano podría tomar varios años.,
Metagenomic NGS (mNGS) es simplemente ejecutar todos los ácidos nucleicos en una muestra, que puede contener poblaciones mixtas de microorganismos, y asignarlos a sus genomas de referencia para entender qué microbios están presentes y en qué proporciones. La capacidad de secuenciar e identificar ácidos nucleicos de múltiples taxones diferentes para el análisis metagenómico hace de esta una nueva y poderosa plataforma que puede identificar simultáneamente material genético de reinos de organismos completamente diferentes.,las posibles aplicaciones clínicas son tremendas, incluyendo el diagnóstico de enfermedades infecciosas, el seguimiento de brotes, la vigilancia del control de infecciones y el descubrimiento de mutaciones y patógenos, entre muchos otros. las mNGS, a veces llamadas secuenciación de escopeta, de muestras clínicas se han aplicado a varios tipos de muestras, incluyendo líquido cefalorraquídeo, sangre, muestras respiratorias, Líquido gastrointestinal y líquido ocular.

¿Cuáles son los beneficios de la secuenciación de próxima generación de Metagenomic?,

la mayor fortaleza de mNGS es que es un método de diagnóstico libre de hipótesis imparcial, a diferencia de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa dirigida (PCR) que se basan en cebadores para la identificación de objetivos específicos para ser amplificados y detectados. Incluso los métodos de PCR universales o de amplio rango no son lo suficientemente amplios como para ser considerados metagenómicos, ya que utilizan cebadores específicos del gen de ARN ribosómico 16S conservado (ARNr) y secuencias de espaciador transcrito interno (ITS) para amplificar secuencias de ácido nucleico distintivas que pueden clasificarse bioinformáticamente en bacterias/arqueas u hongos, respectivamente., los cebadores universales también plantean un problema al diagnosticar infecciones polimicrobiales con pruebas moleculares. Si las poblaciones polimicrobiales están presentes cuando se usa la secuenciación de 16S, se realizarán múltiples llamadas de base por nucleótido, produciendo un cromatograma de nucleótidos mixtos que no se puede interpretar. Si bien hay métodos computacionales convolucionales disponibles para predecir los organismos identificados, estos no están en uso estándar para muchos laboratorios, que a menudo reflejan la secuenciación de próxima generación del gen 16S para muestras polimicrobiales.,

¿cuáles son los desafíos de la secuenciación metagenómica de próxima generación?

A pesar del potencial de mNGS, hay muchas barreras que despejar antes de que la tecnología pueda convertirse en parte del laboratorio convencional, así como lagunas en nuestra comprensión sobre su utilidad diagnóstica. Las principales reservas incluyen la interpretación de los hallazgos (distinguir la contaminación y la colonización de los patógenos verdaderos), la selección y validación de las bases de datos utilizadas para los análisis y la predicción (o falta de ella) de susceptibilidades antimicrobianas., Una percepción común es que mNGS es tan increíblemente sensible que revelará un diagnóstico cuando todas las otras pruebas sean negativas. Mientras que las mNGS pueden ser analíticamente más sensibles que los métodos de cultivo estándar en algunos casos, la eliminación necesaria de grandes cantidades de ácido nucleico humano durante la preparación de secuenciación y (por métodos computacionales) durante el proceso postanalítico, puede disminuir la sensibilidad en comparación con los enfoques de PCR específicos para muchos organismos.

La especificidad de mNGS sigue siendo el elefante proverbial en la habitación., La contaminación de las muestras durante la recolección de muestras es una gran preocupación dada la mayor sensibilidad analítica de las mNGS en comparación con los métodos de cultivo estándar, y es necesario contar con un proceso de control de calidad validado para pasos desde la evaluación de la pureza del reactivo hasta la medición de controles adecuados de cobertura del genoma. Además, con algunas plataformas Illumina, se pueden designar los índices de códigos de barras incorrectos, lo que lleva a falsos positivos en la secuenciación de datos., Los controles de calidad bioinformáticos son necesarios para garantizar que los genomas validados y de alta calidad estén disponibles con errores mínimos en la base de datos, y lo ideal sería que hubiera personal bioinformático disponible para interpretar los resultados de la secuenciación de cada prueba, que no está disponible en la mayoría de los laboratorios microbiológicos clínicos., La Administración Federal de medicamentos (FDA) ha colaborado con otras agencias federales para curar una base de datos titulada FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), que ha sido útil para garantizar que los resultados actuales de mNGS sean confiables y precisos, pero estos recursos deben actualizarse y mantenerse.
La mayor pregunta sigue siendo en torno a la especificidad clínica de mNGS: ¿son las secuencias detectadas de patógenos que están contribuyendo a la enfermedad actual del paciente?, La especificidad analítica de las pruebas mNGS se puede abordar con controles rigurosos a lo largo de la colección de muestras, la preparación de la biblioteca de secuenciación, la ejecución del ensayo y la clasificación bioinformática, pero la especificidad clínica no se aborda directamente con estos enfoques. Las preguntas que pueden ayudar a determinar la utilidad clínica y la aplicabilidad incluyen: ¿Cómo podemos distinguir los organismos relacionados con la bacteremia transitoria de la flora oral/gastrointestinal o colonizadores de la piel en las pruebas de sangre/plasma mNGS?, ¿Cómo se debe informar la profundidad de la secuencia y qué tan confiable es la relación de la profundidad de la secuencia con la infección verdadera? ¿Esta relación difiere según el patógeno / huésped? ¿Cuánto tiempo es la semivida detectable esperada de un patógeno por mNGS una vez que el paciente está recibiendo la terapia curativa apropiada? Los estudios sobre la utilidad clínica y la rentabilidad son muy necesarios a pesar del poder indiscutible de esta tecnología desde una perspectiva de investigación y descubrimiento.,
También vale la pena señalar que actualmente no hay pruebas mNGS aprobadas o aprobadas por la FDA que puedan enviarse para pruebas microbianas, aunque hay laboratorios certificados bajo las Enmiendas de mejora de Laboratorio Clínico de 1988 (CLIA ’88) que ofrecen pruebas en muestras clínicas. Hasta la fecha, solo unos pocos sistemas de diagnóstico NGS han sido aprobados por la FDA para pruebas oncológicas o detección de fibrosis Quística, por ejemplo., Una revisión reciente describe en detalle muchos de los obstáculos regulatorios y consideraciones que deberán abordarse antes de que las mNGS puedan ingresar a los laboratorios de diagnóstico clínico convencionales como una prueba validada por la FDA.
En resumen, mientras que las pruebas mNGS pueden jugar un papel importante en el flujo de trabajo de diagnóstico microbiológico en el futuro, particularmente a medida que evoluciona la secuenciación y la potencia de procesamiento bioinformático, esta sigue siendo una tecnología de alta complejidad para la cual la utilidad clínica en nuestro entorno de práctica médica actual sigue siendo incierta., Aunque las pruebas mNGS pueden ofrecer nuevas y emocionantes oportunidades clínicas de diagnóstico en el futuro cercano, es probable que ninguna de ellas reemplace a un médico astuto en el corto plazo.