las conexiones genéticas entre las vías de reparación del ADN y la predisposición humana al cáncer han alimentado el interés en las proteínas que reconocen y reparan sitios específicos de daño del ADN. Las enzimas de reparación se conservan notablemente desde bacterias hasta hongos y humanos, lo que subraya la importancia que se concede al mantenimiento de la integridad genómica frente a una carga mutagénica., El ADN es susceptible a daños causados por errores cometidos durante la replicación y por factores ambientales, como la radiación, oxidantes o agentes alquilantes. Las reacciones de reparación implican la escisión de bases químicamente alteradas o mal apareadas del dúplex de ADN. Los huecos resultantes son rellenados por las polimerasas de ADN; esta reacción deja una muesca en o flanqueando el sitio de reparación. Un proceso análogo ocurre durante la replicación del ADN cromosómico, por el cual los segmentos de 5′-ARN que preparan la síntesis discontinua de fragmentos de Okazaki son extirpados, y los huecos intermedios son rellenados por la ADN polimerasa.,

las vías de reparación y replicación del ADN convergen en un paso final común en el que la continuidad de la cadena de ADN reparada es restaurada por la ADN ligasa, una enzima que convierte las nicks en enlaces fosfodiéster. Las muescas son lesiones potencialmente deletéreas del ADN que, si no se corrigen, pueden dar lugar a roturas letales de doble hebra. En consecuencia, la pérdida total de la función de la ligasa de ADN es letal.

reacción de la DNA ligasa

Las DNA ligasas catalizan la Unión de una hebra terminada en 5′-fosfato a una hebra terminada en 3′-hidroxilo., La ligadura depende del magnesio y de un cofactor de alta energía, ya sea ATP o NAD+. El mecanismo de reacción involucra 3 reacciones secuenciales de transferencia de nucleótidos. En el primer paso, el ataque nucleofílico sobre el Alfa-fósforo del ATP (trifosfato de adenosina) o NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) por ligasa resulta en la liberación de pirofosfato o NMN (nicotinamida mononucleótido) y la formación de un intermediario covalente (ligasa-adenilato) en el que AMP se une a través de un enlace fosfoamida (P-N) al grupo epsilon-amino de una lisina., En el segundo paso, el AMP se transfiere al extremo 5’de la cadena de ADN terminada con fosfato 5’para formar ADN-adenilato – una estructura puente de pirofosfato invertida, AppN. En esta reacción, el oxígeno 5′-fosfato de la cadena de ADN ataca el fósforo de la ligasa-adenilato; la cadena lateral de la lisina del sitio activo es el grupo saliente. En el tercer paso, la ligasa cataliza el ataque por el 3 ‘ – OH del nick en el ADN-adenilato para unirse a los 2 polinucleótidos y liberar AMP.

distribución filogenética

Los organismos vivos comprenden 3 dominios: eubacteria, archaeabacteria y eucariotas., Todos los organismos codifican 1 o más ADN ligasas. Las ligasas se agrupan en 2 familias, ligasas dependientes de ATP y ligasas dependientes de NAD+, de acuerdo con el sustrato nucleótido requerido para la formación de ligasa-adenilato. Las ligasas de ADN dependientes de ATP se encuentran en los 3 dominios. Las ADN ligasas dependientes de NAD + (LigA) son ubicuas en las bacterias, donde son esenciales para el crecimiento y presentan objetivos atractivos para el descubrimiento de fármacos antiinfecciosos. Las ligasas dependientes de NAD + solo se encuentran esporádicamente fuera del dominio bacteriano de la vida, p. ej.,, en arqueas halofílicas y ciertos virus de ADN, y presumiblemente fueron adquiridos en estos taxones por transferencia horizontal de genes.

las ligasas celulares eucariotas dependientes de ATP

Las ligasas de ADN dependientes de ATP se encuentran en todas las especies eucariotas. Las células de mamíferos contienen cuatro isoenzimas de ADN ligasa. Las comparaciones de secuencia de aminoácidos sugieren que un dominio catalítico central Común a todas las ligasas dependientes de ATP está embellecido por dominios específicos de isoenzimas adicionales ubicados en los terminales amino o carboxilo de las proteínas., Se cree que estos segmentos flanqueantes median la Unión de las ligasas de ADN de mamíferos a otras proteínas involucradas en la replicación, reparación y recombinación del ADN. Las isoenzimas de mamíferos se conocen como ligasa I, ligasa IIIa, ligasa IIIb y ligasa IV. la ligasa de ADN I es un polipéptido de 919 aminoácidos, expresado en todos los tejidos, que cataliza la Unión de fragmentos de Okazaki durante la replicación del ADN y también desempeña un papel en la reparación del ADN., Las ADN ligasas IIIA (922 aminoácidos) y IIIb (862 aminoácidos) son productos de un solo gen; difieren en la secuencia de aminoácidos solo en sus terminales carboxílicos como consecuencia del empalme alternativo del ARNm. La ligasa IIIa se expresa ubicuamente y está implicada en la reparación del ADN y es esencial para la función mitocondrial. La expresión de ligasa IIIb está restringida a los testículos, específicamente a los espermatocitos sometidos a meiosis. La ADN ligasa IV es un polipéptido de 911 aminoácidos que desempeña un papel en la reparación de las roturas de ADN de doble hebra a través de la Unión final no homóloga (NHEJ).,

Las células de levadura contienen 2 ligasas de ADN codificadas por separado, que son homólogas a las ligasas de ADN de mamíferos I y IV, respectivamente. La ADN ligasa I (Cdc9p) de la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es esencial para el crecimiento celular. Los experimentos genéticos implican a la ligasa I en el sellado de fragmentos de Okazaki y en la finalización de la reparación de escisión de ADN. En contraste, la ADN ligasa IV de levadura no es esencial para el crecimiento celular. Sin embargo, la deleción del gen LIG4 provoca fenotipos que indican que la ligasa IV cataliza la reparación de roturas de doble hebra en la vía de unión final no homóloga (NHEJ)., La levadura en ciernes no tiene un homólogo aparente de la ADN ligasa III de mamíferos.

las ADN ligasas virales dependientes de ATP

Los virus bacterianos del ADN, como los bacteriófagos de E. coli T4, T6, T7 y T3, codifican sus propias ADN ligasas dependientes de ATP. Las ligasas de ADN dependientes de ATP también son codificadas por virus de ADN eucariótico que conducen parte o todo su ciclo de replicación en el citoplasma. Estos incluyen el virus vaccinia, el virus de la peste porcina africana y el virus de la Clorella PBCV1. El bacteriófago y las ADN ligasas eucariotas virales son más pequeñas que sus contrapartes celulares., La ligasa de ADN de Vaccinia, un polipéptido de 552 aminoácidos, es sorprendentemente similar en el nivel de secuencia de aminoácidos a la ligasa de ADN de mamíferos III. de hecho, la ligasa III está más estrechamente relacionada con la ligasa de vaccinia que con las ligasas de mamíferos I y IV. las ligasas de T4 (487 aminoácidos), T7 (359 aminoácidos), T3 (346 aminoácidos) y el virus de la Clorella (298 aminoácidos) son aún más pequeñas. Hemos demostrado que la ligasa del virus de Chlorella puede complementar el crecimiento de una cepa de levadura en la que se ha eliminado el gen de la ADN ligasa I., Este resultado sugiere que los segmentos de proteína exclusivos de la ligasa de ADN i mucho más grande no son esenciales para el crecimiento de las células de levadura.

Nick-Sensing by DNA Ligases

hemos examinado la interacción de las ligasas eucariotas con el ADN utilizando enzimas codificadas por virus como modelos. La ADN ligasa del virus Vaccinia y la ADN ligasa del virus Chlorella forman un complejo discreto con un ligando de ADN singularmente cortado en ausencia de magnesio que se puede resolver a partir del ADN libre mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa., Las ligasas virales no forman complejos estables con los siguientes ligandos: (I) ADN que contiene una brecha de 1-nucleótido o 2-nucleótido; (ii) el producto de ADN dúplex sellado de la reacción de ligadura; (iii) un duplex singularmente nicked que contiene un terminal 5′-OH en el nick en lugar de un 5′-fosfato; o (iv) un duplex singularmente nicked que contiene una hebra de ARN en el lado 5′-fosfato del nick (10 a 15). Por lo tanto, las ADN ligasas virales dependientes de ATP tienen una función intrínseca de detección de nick.,

El reconocimiento de Nick por la ligasa de ADN de vaccinia y la ligasa de ADN del virus Chlorella también depende de la ocupación de la bolsa de unión de AMP en la enzima, es decir, las mutaciones del sitio activo de la ligasa que suprimen la capacidad de formar el intermediario de ligasa — adenilato también eliminan el reconocimiento de nick; mientras que una mutación que preserva la formación de ligasa-adenilato pero inactiva los pasos posteriores de la reacción de unión de la hebra no tiene efecto en la unión al ADN nicked., El secuestro de un nucleótido extrahelical por la ligasa unida al ADN es una reminiscencia del mecanismo de» volteo de bases » del reconocimiento del Sitio objetivo y la catálisis utilizada por otras enzimas de modificación y reparación del ADN.

aunque la fracción de 5 ‘- fosfato es esencial para la Unión de la ligasa del virus de Chlorella al ADN Mellado, la fracción de 3′-OH no es necesaria para el reconocimiento de nick. La ligasa del virus de Chlorella ata a un ligando nicked que contiene 2’, 3 ‘dideoxy y 5’ -terminales del fosfato pero no puede catalizar la adenilación del 5 ‘ – extremo., Por lo tanto, el 3’-OH es importante para la química del paso 2 a pesar de que no se transforma químicamente durante la formación de ADN-adenilato.

para delinear la interfaz ligasa-ADN, tomamos la huella del sitio de unión de la ligasa en el ADN. El tamaño de la huella de exonucleasa III de la ligasa unida a un único nick en el ADN dúplex es de 19 a 21 nucleótidos. La huella es asimétrica, extendiéndose de 8 a 9 nucleótidos en el lado 3′-OH del nick y de 11 a 12 nucleótidos en el lado 5′-fosfato.,

estructura cristalina de la ADN ligasa-adenilato eucariótico

La ADN ligasa del virus Chlorella (ChVLig) es la ligasa eucariótica dependiente de ATP más pequeña conocida. Como la» mínima » ligasa de ADN, presentó un objetivo atractivo para la determinación de la estructura. Cristalizamos ChVLig y determinamos su estructura a 2 Å de resolución. La enzima consiste en un dominio N-terminal nucleotidiltransferasa (Ntasa) más grande y un dominio C-terminal OB más pequeño con una hendidura entre ellos. Una fracción AMP se ligó covalentemente a Nz de Lys27 en el sitio activo., Por lo tanto, tenemos la estructura de un intermediario catalítico genuino.

dentro del dominio Ntasa hay una bolsa de unión a adenilato compuesta por los seis motivos peptídicos (I, Ia, III, IIIa, IV y V) que definen la superfamilia de enzimas nucleotidiltransferasas covalentes que incluye ADN y ARN ligasas y enzimas que capsulan el ARNm. Motif I (KxDGxR) contiene la lisina a la que AMP se une covalentemente en el primer paso de la reacción de la ligasa. Los aminoácidos en los motivos Ia, III, IIIa, IV y V entran en contacto con AMP y desempeñan funciones esenciales en uno o más pasos de la vía de ligadura., El dominio OB consiste en un barril beta antiparalelo de cinco cadenas más una hélice alfa.

base estructural para el reconocimiento de Nick por una mínima ligasa de ADN «pluripotente»

aunque ChVLig carece de los grandes dominios de flanqueo N-O C-terminal que se encuentran en las ligasas de ADN celular eucariótico, puede sostener el crecimiento mitótico, la reparación del ADN y la Unión final no homóloga en la levadura en ciernes cuando es la única fuente de ligasa en la célula. ChVLig puede incluso realizar las funciones esenciales del lig3 de mamíferos en el metabolismo del ADN mitocondrial., Propusimos que ChVLig representa una ligasa «pluripotente» despojada debido a su función intrínseca de detección de nick, cuya base se iluminó cuando resolvimos la estructura cristalina de 2.3 Å de ChVLig-AMP unida a un nick de 3′-OH/5′-PO4 en ADN dúplex.

ChVLig rodea el ADN como una abrazadera de proteína en forma de C. El dominio NTase se une a las hebras de ADN rotas e intactas en el surco mayor que flanquea el nick y también en el surco menor en el lado 3′-OH del nick. El dominio OB se une a través del surco menor en la cara del dúplex detrás del nick., Un novedoso módulo «latch» -que consiste en un bucle beta – horquilla que emana del dominio OB-ocupa la ranura principal y completa la abrazadera circunferencial a través de contactos entre la punta del bucle y la superficie del dominio NTase. El pestillo es crítico para el cierre de la abrazadera y es un determinante clave de la detección de nick.

La comparación de las estructuras cristalinas del chvlig-AMP libre y ligado a nick revela un gran reordenamiento de dominio que acompaña al reconocimiento de nick., En el chvlig-AMP libre, el dominio OB se refleja lejos del dominio NTase para exponer completamente la superficie de unión del ADN por encima del bolsillo de unión del AMP. El segmento peptídico que está destinado a convertirse en el pestillo está desordenado en la ligasa libre y es sensible a la proteólisis. Pero este segmento está protegido de la proteólisis cuando ChVLig se une al ADN cortado. La Unión del ADN implica una rotación de casi 180 del dominio OB alrededor de un eslabón giratorio, de modo que la superficie cóncava del barril beta OB encaja en el surco menor del ADN., Esta transición provoca un movimiento de 63 Å del dominio OB y coloca el pestillo profundo en la ranura principal del ADN.

una red de interacciones con los terminales 3′-OH y 5′-PO4 en el sitio activo iluminó el mecanismo de adenililación del ADN y los roles críticos del AMP en la detección de nick y la catálisis. La adición de un catión divalente desencadenó el sellado de nick en cristalo, estableciendo así que el complejo nick es un intermediario genuino en la vía de reparación del ADN.,

estructura de la ligasa de ADN dependiente de NAD+unida a ADN-adenilato Nicked

Las ligasas de ADN dependientes de NAD+(conocidas como LigA) son un clado distintivo y estructuralmente homogéneo de enzimas que se encuentran en todas las bacterias. E. coli LigA (671-aa) es el prototipo de esta familia. LigA tiene una arquitectura modular construida alrededor de un núcleo de ligasa central compuesto por un dominio NTase y un dominio OB. El núcleo está flanqueado por un dominio N-terminal «Ia» y tres módulos C-terminal: un dedo tetracisteína zinc, un dominio hélice-horquilla-hélice (HhH), y un dominio BRCT., Cada paso de la vía de ligadura depende de un subconjunto diferente de los dominios de LigA, con solo el dominio NTase siendo requerido para todos los pasos. El dominio Ia es exclusivo de las ligasas dependientes de NAD+, es responsable de unir la fracción NMN de NAD+, y es necesario para que la reacción con NAD+ forme el intermedio de ligasa-AMP.

encontramos que la ligasa de ADN de E. coli dependiente de NAD+puede apoyar el crecimiento de cepas de Saccharomyces cerevisiae eliminadas individualmente para CDC9 o doblemente para CDC9 más LIG4., Esta es la primera demostración de que una enzima dependiente de NAD+es biológicamente activa en un organismo eucariótico. Estudios posteriores (en colaboración con Maria Jasin) mostraron que E. coli LigA podría ser suficiente para la función de la ligasa en células ES de ratón que carecen de la enzima esencial Lig3.

Nuestra estructura cristalina de E. coli LigA unida al intermedio ADN-adenilato nicked reveló que LigA también rodea la hélice de ADN como una abrazadera de proteína en forma de C. La interfaz proteína-ADN implica extensos contactos de ADN por los dominios Ntasa, OB y HhH sobre un segmento de 19-bp de ADN dúplex centrado en el nick., El dominio Ntasa se une a las hebras de ADN rotas en y flanqueando el nick, el dominio OB entra en contacto con la hebra de plantilla continua que rodea el nick, y el dominio HhH se une a ambas hebras a través del surco menor en la periferia de la huella. El módulo Zn-finger juega un papel estructural en el puente entre los dominios OB y HhH. El dominio Ia no hace contactos con el duplex de ADN, consistente con su dispensabilidad para catalizar el cierre de la hebra en un sustrato de AppDNA.,

Los dominios De La Liga Ntasa y OB se colocan de manera similar en la circunferencia de ADN a los dominios Ntasa y OB de las ligasas de ADN dependientes de ATP, y «huella» segmentos similares de las hebras de ADN. Sin embargo, la topología de la abrazadera de LigA es claramente diferente de las abrazaderas formadas por ChVLig y la ADN ligasa humana 1 (hulig1, determinada por Tom Ellenberger y sus colegas). Los contactos besadores que cierran la abrazadera de LigA son sui generis, involucrando el dominio NTase y el dominio C-terminal HhH., Con base en los datos estructurales disponibles, está claro que las ligasas de ADN han evolucionado al menos tres medios diferentes de rodear el ADN.

Las comparaciones del complejo de E. coli LigA—AppDNA con estructuras de otras ligasas bacterianas capturadas como el complejo binario LigA•—NAD+ (sustrato de paso 1), El complejo binario LigA•—NMN (grupo que sale después del paso 1) y el intermedio covalente ligasa-AMP (producto de paso 1 después de la disociación del grupo) destacan reordenamientos masivos de dominio de proteínas (del orden de 50 a 90 Å) que ocurren en sincronía con la unión al sustrato y la catálisis., La Unión del ADN y la formación de clamp por LigA implica una rotación de casi 180 del dominio OB de modo que la superficie cóncava del barril beta OB encaja en el surco menor, similar a lo que se ve o se infiere para ChVLig y HuLig1. La Unión de cuatro puntos del dominio HhH en la periferia de la huella de ADN de LigA estabiliza una curva de ADN centrada en el nick. Las interacciones LigA-ADN que flanquean inmediatamente la muesca inducen una distorsión local del ADN, lo que resulta en la adopción de una hélice de forma a similar al ARN, haciéndose eco nuevamente de los hallazgos del cocristal de ADN HuLig1.,

mecanismo de la adenililación de lisina por ligasas polinucleótidas dependientes de ATP y nad+dependiente

la reacción de autoadenililación de las ligasas polinucleótidas se realiza mediante un dominio nucleotidiltransferasa (Ntasa) que se conserva en las ligasas de ADN y ARN dependientes de ATP y en las ligasas de ADN dependientes de NAD+. El dominio Ntasa incluye la definición de motivos peptídicos que forman el bolsillo de unión de nucleótidos. Motif I (KxDG) contiene la lisina que se une covalentemente al AMP. Como Robert Lehman señaló en 1974, no está claro cómo lisina (con un valor predicho de pKa de ~10.,5) pierde su protón a pH fisiológico para alcanzar el estado no fumado requerido para atacar el fósforo α de ATP o NAD+. En principio, la ligasa podría emplear una base general para desprotonar la lisina. Alternativamente, el pKa podría ser reducido por el potencial de carga positiva de los aminoácidos proteicos que rodean la lisina-Nz. Varias estructuras cristalinas de ligasas ausentes de metales proporcionaron escaso apoyo para ambas explicaciones. En estas estructuras, el motivo I lisina nucleófilo se encuentra junto a un motivo IV glutamato o aspartato cadena lateral., La lisina y el carboxilato motif IV forman un par iónico, cuyo efecto anticipado es aumentar el pKa de lisina en virtud de la carga negativa circundante. Es poco probable que un anión glutamato o aspartato pueda servir como base general para abstraer un protón del catión lisina. Una posible solución al problema sería si un catión divalente colinda con la lisina-Nz y reduce su pKa.,

un mecanismo metal-conducido fue revelado por nuestra estructura cristalina reciente de la ligasa del ARN de Naegleria gruberi (NgrRnl) como Complejo de Michaelis del paso 1 con ATP y manganeso (su cofactor preferido del metal). La clave para capturar el complejo similar a Michaelis fue la sustitución del nucleófilo de lisina por una metionina isostérica. La estructura de 1,9 Å contenía ATP y dos iones de manganeso en el sitio activo. El metal «catalítico» se coordinó con la geometría octaédrica a cinco aguas, que a su vez fueron coordinadas por las cadenas laterales de carboxilato de residuos conservados en los motivos I, III y IV., El sitio del sexto ligando en el complejo metálico catalítico fue ocupado por un ATP α fosfato oxígeno, indicativo de un papel para el metal en la estabilización del Estado de transición de la reacción de auto-adenililación. Una visión clave, fortificada por la superposición del complejo Michaelis en la estructura del intermedio covalente NGRRNL-(Lys-Nz)–AMP, se refería al papel del complejo metálico catalítico en la estabilización del Estado no protonado del nucleófilo de lisina antes de la catálisis, a través de la carga positiva local y el contacto atómico de Lys-Nz con una de las aguas unidas al metal., El complejo Ngrrnl Michaelis reveló un segundo metal, coordinado octaédricamente a cuatro aguas y a los oxígenos de fosfato ATP β y γ. El complejo metálico y el fosfato γ de ATP fueron comprometidos por un conjunto de cadenas laterales de aminoácidos (únicas de NgrRnl) que colectivamente orientan el PPi dejando el grupo apical al nucleófilo de lisina. Consistente con un mecanismo en línea de un solo paso, El fosfato α se invirtió estereoquímicamente durante la transición del complejo Ngrrnl•ATP Michaelis al intermedio lysil-AMP.,

se cree que las ligasas de ADN han evolucionado por separado de las ligasas de ARN, inicialmente por fusión de un dominio Ntasa ancestral que utiliza ATP a un dominio OB C-terminal (para comprender el núcleo catalítico mínimo de una ligasa de ADN), y posteriormente a través de la fusión de módulos estructurales adicionales al núcleo Ntasa-OB (7). Las ADN ligasas dependientes de NAD + (enzimas LigA), que son ubicuas en las bacterias y esenciales para la viabilidad bacteriana, adquirieron su especificidad para NAD+ a través de la fusión de un módulo de dominio Ia de unión a NMN al N-terminal del dominio Ntasa., Escherichia coli DNA ligase (EcoLigA) fue la primera ligasa de ADN celular descubierta y caracterizada y sigue siendo el principal modelo para estudios estructurales y funcionales de la familia de ADN ligasa dependiente de NAD+. El interés en el mecanismo de LigA es impulsado por la promesa de dirigirse a LigA (a través de su especificidad de sustrato NAD+ y características estructurales únicas vis à vis ligasas de ADN humano) para el descubrimiento de fármacos antibacterianos.

resolvimos una estructura cristalina de 1.55 Å de EcoLigA como un complejo Michaelis con nad+ y magnesio., La estructura revela un mecanismo de un solo metal en el que un complejo Mg2+(H2O)5 unido a la ligasa reduce la lisina pKa y engancha el fosfato NAD+ α, pero el fosfato β y el nucleósido de nicotinamida del grupo saliente NMN están orientados únicamente a través de interacciones atómicas con elementos proteicos que son exclusivos del clado LigA. La dicotomía de dos metales (para ligasa dependiente de ATP) versus uno metálico (para ligasa dependiente de NAD+) demarca un punto de ramificación en la evolución de la ligasa.