la prueba de oxidasa detecta la presencia de un sistema de citocromo oxidasa que catalizará el transporte de electrones entre los donantes de electrones en las bacterias y un colorante redox – tetrametil-P-Fenileno-diamina. El tinte se reduce a color púrpura oscuro., Esta prueba se utiliza para ayudar en la identificación de Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella y Pasteurella, todos los cuales producen la enzima citocromo oxidasa.

se pueden utilizar varios reactivos para esta prueba.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Los organismos que contienen citocromo c como parte de su cadena respiratoria son oxidasa-positivos y tornan el reactivo azul/púrpura. Los organismos que carecen de citocromo c como parte de su cadena respiratoria No oxidan el reactivo, dejándolo incoloro dentro de los límites de la prueba, y son oxidasa negativa.

Las bacterias oxidasa positivas poseen citocromo oxidasa o indofenol oxidasa (una hemoproteína que contiene hierro). Ambos catalizan el transporte de electrones desde los compuestos donantes (NADH) a los aceptores de electrones (generalmente oxígeno)., El reactivo de ensayo, n, N, n’, n’-tetrametil-p-fenilendiamina Dihidrocloruro, actúa como aceptor artificial de electrones para la enzima oxidasa. El reactivo oxidado forma el compuesto coloreado azul indofenol.

el sistema citocromo generalmente solo está presente en organismos aeróbicos que son capaces de utilizar oxígeno como receptor final de hidrógeno. El producto final de este metabolismo es agua o peróxido de hidrógeno (descompuesto por catalasa).

Propósito/Usos de la Prueba de Oxidasa

• La prueba de oxidasa se utiliza para determinar si un organismo posee la enzima citocromo oxidasa.,
• la prueba se utiliza como ayuda para la diferenciación de especies de Neisseria, Moraxella, Campylobacter y Pasteurella (oxidasa positiva).
• también se usa para diferenciar pseudomonas de especies relacionadas.

procedimiento de la prueba de oxidasa

hay muchas variaciones del método a la prueba de oxidasa. Estos incluyen, pero no se limitan a, la prueba de papel de filtro, el método de placa directa, el método de hisopo, el método de tira de prueba de oxidasa impregnada y el método de tubo de ensayo. Todos los tiempos y concentraciones se basan en las recomendaciones originales.,

método de papel de filtro seco

dado que el reactivo oxidasa es inestable y tiene que estar recién preparado para su uso, este método es conveniente.

1. La tira de papel de filtro no. 1 de Whatman se remoja en una solución al 1% recién preparada de dihidrocloruro de tertrametil-P-fenilenodiamina.
2. Después de drenar durante unos 30 segundos, las tiras se liofilizan y se almacenan en una botella oscura herméticamente sellada con un tapón de rosca.
3. para su uso, se retira una tira, se coloca en una placa de petri y se humedece con agua destilada.,
4. La Colonia a probar se recoge con un lazo de platino y se unta sobre el área húmeda.
5. Una reacción positiva se indica por un intenso tono púrpura profundo, que aparece en 5-10 segundos, una reacción «positiva retardada» por coloración en 10-60 segundos, y una reacción negativa por ausencia de coloración o por coloración después de 60 segundos.

método de papel de filtro húmedo

1. Una tira de papel de filtro se empapa con una pequeña solución al 1% recién hecha del reactivo.
2. una mota de cultivo se frota sobre ella con un lazo de platino.,
3. Una reacción positiva se indica por un intenso tono púrpura profundo, que aparece en 5-10 segundos, una reacción «positiva retardada» por coloración en 10-60 segundos, y una reacción negativa por ausencia de coloración o por coloración después de 60 segundos.

método directo de la placa

1. añadir 2 -3 gotas de reactivo directamente a las colonias sospechosas en una placa de agar. No inunde la placa con el reactivo.
2. Observe el cambio de color en 10 segundos.

Nota: el método de placa directa debe llevarse a cabo en una placa de agar no selectiva.,

1. Cuando se utiliza el reactivo oxidasa de Kovac, los microorganismos son oxidasa positiva cuando el color cambia a púrpura oscuro dentro de 5 a 10 segundos. Los microorganismos se retrasan oxidasa positiva cuando el color cambia a púrpura dentro de 60 a 90 segundos. Los microorganismos son oxidasas negativas si el color no cambia o tarda más de 2 minutos.
2. Cuando se usa el reactivo Gordon y McLeod, los microorganismos son oxidasa positiva cuando el color cambia a rojo dentro de 10 a 30 minutos o a negro dentro de 60 minutos. Los microorganismos son oxidasas negativas si el color no cambia.,

método del hisopo

1. sumergir el hisopo en el reactivo y luego tocar una colonia sospechosa aislada
2. observar el cambio de color dentro de 10 segundos.

método de tubo de ensayo

1. cultivar un cultivo fresco (18 a 24 horas) de bacterias en 4,5 ml de caldo nutritivo (o medio estándar que no contiene una alta concentración de azúcar).
2. Añadir 0,2 ml de α-naftol al 1%, a continuación, añadir 0,3 ml de oxalato de P-aminodimetilanilina al 1% (reactivos Gaby y Hadley).
3. agitar vigorosamente para asegurar la mezcla y la oxigenación completa del cultivo.,
4. Observe los cambios de color.
5. Los microorganismos son oxidasa positiva cuando el color cambia a azul dentro de 15 a 30 segundos. Los microorganismos se retrasan oxidasa positiva cuando el color cambia a púrpura dentro de 2 a 3 minutos. Los microorganismos son oxidasas negativas si el color no cambia.

interpretación del resultado de la prueba de oxidasa

resultado positivo

el desarrollo de un color azul / púrpura intenso indica la producción de oxidasa en 5-10 segundos.

resultado negativo

sin color azul púrpura / sin cambio de color.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

control de calidad para la prueba de oxidasa

control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

limitaciones de la prueba de oxidasa

1. Se ha demostrado que los reactivos utilizados en la prueba de oxidasa se auto-oxidan, por lo que es muy importante utilizar reactivos frescos, no mayores de 1 semana.
2. tanto las bacterias como las levaduras cultivadas en medios que contienen altas concentraciones de glucosa muestran una actividad inhibida de la oxidasa, por lo que se recomienda probar colonias cultivadas en medios sin exceso de azúcar, como el agar nutriente., El agar triptico de soja también es un excelente medio.
3. Las bacterias cultivadas en medios que contienen colorantes pueden dar resultados aberrantes.
4. Los reactivos de prueba matarán efectivamente a los microorganismos, por lo que el subcultivo debe realizarse antes de agregar cualquier reactivo a un cultivo activo.
5. La prueba de oxidasa puede ser utilizada en la identificación presunta de Neisseria y en la diferenciación e identificación de bacilos gram-negativos. Los organismos oxidasa-positivos deben ser examinados por tinción de gram para determinar la morfología y la reacción de gram., Se recomiendan pruebas bioquímicas adicionales para una identificación completa.
6. El uso de un nicromo u otro bucle que contenga hierro puede producir reacciones falsas positivas. Se recomiendan bucles de platino.
7. La mayoría de los Haemophilus son oxidasa-positivos. Las tiras o reactivos menos sensibles pueden dar resultados falsos negativos.
8. Las reacciones oxidasas de los bacilos gramnegativos deben determinarse en medios no selectivos y no diferenciales para garantizar resultados válidos. Además, las colonias tomadas de medios que contienen altos niveles de glucosa pueden dar reacciones negativas falsas.,
9. Se recomienda usar colonias que tengan entre 18 y 24 horas de edad. Las colonias más viejas producirán reacciones más débiles.
10. cualquier cambio de color que aparezca después de 20 segundos no debe tenerse en cuenta.