después de haber estudiado en la RADA de 1992 a 1995, Macfadyen se hizo conocido en el teatro británico principalmente por su trabajo con la compañía teatral Cheek by Jowl, para la que interpretó a Antonio en The Duchess of Malfi, Charles Surface en The School for Scandal, y Benedick en Much Ado About Nothing. Su Benedick fue interpretado como un bufón de clase oficial con un bigote y una risa rebuznante. En 2005, interpretó al príncipe Hal en Enrique IV, partes uno y dos en el Royal National Theatre, con Michael Gambon en el papel de Falstaff., En 2007, regresó al escenario, retratando a un estadounidense, Clay, un padre ama de casa con una actitud liberal en la obra the Pain and the Itch.
un gran avance en la televisión llegó cuando apareció como Hareton Earnshaw en una adaptación de Cumbres Borrascosas, proyectada en la red ITV en 1998. Más trabajo de drama de televisión siguió, incluyendo papeles protagonistas en los dramas Warriors (1999) y The Way We Live Now (2001), ambos para la BBC. También en 2001, obtuvo elogios por su papel protagonista en la serie dramática de BBC Two Perfect Strangers, que fue escrita y dirigida por Stephen Poliakoff., En 2002, protagonizó el proyecto, un drama de la BBC que traza el ascenso al poder de New Labour. Protagonizó Spooks, que se convirtió en un éxito cuando se proyectó en BBC One. Una segunda temporada más larga se proyectó en 2003, y una tercera temporada se emitió en otoño de 2004, con él dejando la serie en el segundo episodio. La serie fue transmitida como MI-5 en la red a& E. En 2007 apareció en el drama de Channel 4 Secret Life, que trataba sobre el controvertido tema de la pedofilia., Macfadyen ganó el premio al Mejor Actor en los Premios Royal Television Society 2007 por esta parte, y fue nominado para un BAFTA. También apareció en un breve sketch para Comic Relief como el novio en Mr. Bean’s Wedding, junto a Rowan Atkinson y Michelle Ryan.
busto del Sr. Darcy interpretado por Matthew Macfadyen en Pride& Prejudice (película de 2005)
Macfadyen apareció en películas como Enigma (estrenada en 2001), y en la guarida de mi padre, por la que recibió el Premio de Nueva Zelanda al mejor actor., Interpretó al protagonista Romántico Fitzwilliam Darcy en una adaptación de Pride and Prejudice, estrenada en el Reino Unido en septiembre de 2005.
Macfadyen protagonizó Death at a Funeral de Frank Oz y la película Incendiary, basada en la novela de Chris Cleave junto a Michelle Williams y Ewan McGregor. También apareció en la película de Ron Howard Frost / Nixon, en la que interpretó a John Birt. En 2008, interpretó al protagonista masculino Arthur Clennam en la adaptación de la BBC de la pequeña Dorrit de Charles Dickens., En 2009 Macfadyen apareció junto a la actriz nominada al Oscar Helena Bonham Carter en la película de la BBC Four Enid, basada en la vida de Enid Blyton, como Hugh Pollock, editor de Blyton y primer marido.
en 2010, interpretó al Sheriff de Nottingham en Robin Hood. Interpretó al Prior Philip en la serie de televisión The Pillars of the Earth, y fue el Logan Mountstuart de mediana edad en Any Human Heart. En junio de 2010, Macfadyen ganó un Premio de la Academia Británica de televisión al Mejor Actor de reparto por su trabajo en la Justicia Penal.,
en 2011, Macfadyen hizo un cameo final en el programa de la BBC Spooks, y en 2012, interpretó a Oblonsky en la película de Joe Wright, Anna Karenina. En diciembre de 2012 comenzó a interpretar al Detective Inspector Edmund Reid en Ripper Street DE BBC One.
en 2013-14 interpretó a Jeeves en la producción de Jeeves y Wooster en Perfect Nonsense en el Teatro Duke of York en el West End de Londres. La obra ganó el Premio Olivier 2014 a la mejor comedia nueva.
en 2015 Amazon Prime recogió Ripper Street y, después de buenas críticas, fue revisionado para la cuarta y Quinta temporadas., Macfadyen dijo que estaba «encantado de embarcarse en otra dosis de Ripper Street: sangre y tripas, relojes de bolsillo y sombreros victorianos, historias maravillosamente oscuras, conmovedoras y misteriosas del Sr. Richard Wardlow». La serie también se emitió en los Estados Unidos en BBC America. También en 2015, fue estrella invitada en el episodio piloto de The Last Kingdom.
actualmente interpreta a Tom Wambsgans en la sucesión de la serie de HBO, por la que recibió una nominación al Premio Primetime Emmy.,
en 2020, apareció en el papel del mayor Charles Ingram en un drama de ITV de tres partes, Quiz, basado en el controvertido escándalo de toser cheat en Who Wants to be a Millionaire en 2001.