la prueba de coagulasa es el método más confiable para identificar Staphylococcus aureus. La producción de coagulasa se puede detectar usando la prueba de la coagulasa de la diapositiva (SCT) o la prueba de la coagulasa del tubo (TCT)., Slide coagulase detecta la coagulasa unida (también llamada «factor de aglutinación»), que reacciona directamente con el fibrinógeno en el plasma, causando una rápida aglutinación celular. Los aislamientos negativos tras el TCM requieren confirmación con el TCT superior, ya que las cepas deficientes en factor de aglutinación suelen producir coagulasa libre. La coagulasa tubular detecta la coagulasa libre extracelular secretada que reacciona con una sustancia en el plasma llamada «factor de reacción a la coagulasa» (CRF) para formar un complejo, que a su vez reacciona con el fibrinógeno para formar fibrina (el coágulo) ., Se han aislado cepas de estafilococos animales coagulasa-positivos de muestras clínicas humanas, sin embargo, algunos aislados de estafilococos animales también fermentan manitol . Este estudio evaluó el desempeño de TCTs, DNasa y AMS, los métodos fenotípicos comúnmente utilizados en la identificación de Staphylococcus aureus.

detección de Staphylococcus aureus con las pruebas fenotípicas disponibles

PCR-amplificación del gen nuc, que se utilizó como prueba basal, detectó 32 Staphylococcus aureus de los 60 aislados estafilocócicos, Ver Tabla 2., De los 32 aislados de Staphylococcus aureus nuc-positivos, MSA detectó el mayor número de aislados (30 de 32, 94%) mientras que el TCT (plasma humano y ovino respectivamente) detectó 29 y 27 de los 32 aislados (91% y 84% respectivamente), Tabla 2. DNase detectó el menor número de aislados (24 de 32, 75%).

nueve de los 32 aislados de Staphylococcus aureus nuc positivos (28%) fueron coagulasa negativa, lo que implica que algunos aislados pueden ser identificados erróneamente por el TCT como una única prueba. El Staphylococcus aureus coagulasa negativo probablemente puede ser aislados de SARM que se reportan para reaccionar débil o negativamente con TCTs, o cepas raras de Staphylococcus aureus que se reportan para ser coagulasa negativo . Dos aislados de Staphylococcus aureus (6%) también fueron negativos para la AMS., Shittu et al también reportaron Staphylococcus aureus manitol negativo resistente a la meticilina . Además, ocho de los 32 aislados de Staphylococcus aureus nuc-positivos fueron DNasa negativa (25%). Rao et al reportaron Staphylococcus aureus DNase negativo pero sin explicación para estos hallazgos . Seis estafilococos distintos de los aislados de Staphylococcus aureus confirmados por el nuc produjeron colonias amarillas en la AMS, y otros investigadores informaron hallazgos similares . Otro hallazgo raro en este estudio fue un aislado que era DNasa positiva pero MSA negativo y tubo coagulasa negativo (i. e., no Staphylococcus aureus). Suponemos que este aislado podría haber sido Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, que según el método estándar nacional también es DNasa positiva .

las pruebas fenotípicas únicas son ineficientes para la identificación de Staphylococcus aureus

utilizamos sensibilidad y especificidad para evaluar el desempeño de las pruebas individuales en la detección de Staphylococcus aureus., El crecimiento en la AMS fue el más sensible (94% de sensibilidad), seguido por el TCT (plasma humano y ovino, 91% y 81% de sensibilidad respectivamente), mientras que la prueba de DNasa fue el menos sensible (75% de sensibilidad). Por el contrario, la prueba de DNasa fue la más específica (96% de especificidad) seguida de la AMS (79% de especificidad), mientras que la TCT (plasma humano y plasma ovino) fue la menos específica (11% y 7%, respectivamente) Tabla 3. En general, de las pruebas individuales estudiadas, el crecimiento en ams fue el mejor para identificar Staphylococcus aureus (94% de sensibilidad y 79% de especificidad)., Nuestros resultados difieren ligeramente de los de Han et al, quienes reportaron sensibilidad y especificidad de 76,5% y 99,6%, respectivamente, para la AMS . D’Souza et al, también reportaron sensibilidad del 71%, un poco menor que la nuestra . La alta sensibilidad de la AMS en la detección de Staphylococcus aureus podría deberse a su capacidad para aislar el Staphylococcus aureus patógeno, diferenciando los estafilococos coagulasa negativos de los estafilococos coagulasa positivos.,

para la coagulasa tubular, el plasma humano fue más sensible que el plasma ovino (91% vs.81% de sensibilidad), lo que el plasma de ovejas con tcts puede detectar más aislados falsos negativos. Por lo tanto, en este entorno, es poco probable que el plasma de ovejas reemplace al plasma humano por TCT de rutina., Nuestros datos están de acuerdo con hallazgos anteriores en los que otros investigadores informaron una sensibilidad del 94-100%. Sin embargo, en este estudio, la sensibilidad para el plasma humano y ovino fue mayor que la notificada en otros entornos, donde se notificaron valores tan bajos como el 54,5% (plasma humano) y el 45,5% (plasma ovino). Por lo tanto, con las pruebas de coagulasa, el rendimiento del plasma varía con el ajuste y la elección del plasma puede influir en la eficiencia de la prueba. Además, el uso de EDTA o citrato como anticoagulante influye en la realización de la prueba., Cabe destacar que el citrato solo afecta las reacciones de la coagulasa de los enterococos donde se utiliza, pero no afecta a los organismos productores de coagulasa como Staphylococcus aureus.

la prueba de DNasa tuvo una sensibilidad del 75% y una especificidad del 96%, que son comparables a otros estudios en los que se relataron una sensibilidad del 75% y una especificidad del 100%. En este estudio, la prueba de DNasa fue la más específica de todas las pruebas y tuvo el menor número de aislados falsos positivos (solo hubo un falso positivo)., Esto estuvo de acuerdo con otros relatos, en los que la prueba de DNasa fue relatada como superior a la TCT . El crecimiento en la AMS también fue altamente específico (79% de especificidad), mientras que la prueba menos específica fue la coagulasa tubular (plasma humano y ovino, 11% y 7% de especificidad, respectivamente).

en contraste, otros estudios reportaron alta especificidad (93,6%) para plasma humano y ovino con TCTs ., La baja especificidad en nuestro estudio puede deberse en parte a la detección no específica de otros estafilococos coagulasa positivos, como Staphylococcus schleiferi subespecie coagulans, Staphylococcus Delphini, Staphylococcus intermedius y Staphylococcus hyicu S. Staphylococcus Delphini y Staphylococcus intermedius son aislados clínicos raros, mientras que Staphylococcus hyicu s es indeterminado (con una prevalencia que varía del 11% al 89%). La prevalencia de estos aislados puede ser alta en ciertos entornos., Aunque la AMS y la DNasa tuvieron altas especificidades y sensibilidades, como pruebas individuales , su uso en la identificación rutinaria de Staphylococcus aureus se ve restringido por su capacidad para detectar otros aislados bacterianos, y se utilizan principalmente durante las pantallas iniciales . De hecho, se han notificado en Nigeria y Japón contras positivas a la sal de manitol (Staphylococcus caprae, S. hemolyticus y S. saprophyticus)., Por lo tanto, en ciertos entornos, si se usa individualmente para identificar Staphylococcus aureus, las pruebas fenotípicas comunes pueden ser insuficientes; algunos aislados se identificarán erróneamente, ya sea como Staphylococcus aureus o CoNS.

una combinación de MSA y DNasa mejora la prueba de coagulasa del tubo

evaluamos la sensibilidad y especificidad de las combinaciones de prueba (es decir, MSA/DNasa / TCT) para detectar Staphylococcus aureus, con el objetivo de mejorar el rendimiento de la TCT., Se alcanzó especificidad absoluta (100%) en la detección de Staphylococcus aureus con combinaciones test, con excepción de la combinación DNasa/MSA (92% de especificidad). Por el contrario, la sensibilidad de las combinaciones de pruebas varió, siendo la MSA/DNasa/TCT (plasma humano) la más sensible (sensibilidad del 75%), mientras que la MSA/DNasa/TCT (plasma ovino) fue la menos sensible (sensibilidad del 25%), Tabla 3.

una combinación de AMS / DNasa resultó en especificidad y sensibilidad de 92% y 96%, respectivamente, y esta sería la combinación de elección para la identificación de Staphylococcus aureus., Sin embargo, dado que ambas pruebas no son específicas para Staphylococcus aureus y pueden detectar otros aislados bacterianos, la combinación dual solo puede usarse para mejorar el TCT. Aunque otras combinaciones de prueba-MSA/DNasa/TCT (plasma humano) y MSA/TCT (plasma humano) tuvieron especificidad de 100%, tuvieron sensibilidad variable (75% y 33%, respectivamente). En esta línea, una combinación de MSA/DNasa/TCT (plasma humano) es mejor para identificar Staphylococcus aureus (100% de especificidad, 75% de sensibilidad) que la combinación de MSA/TCT (plasma humano) (100% de especificidad, 33% de sensibilidad)., Asimismo, las combinaciones DNasa/TCT (plasma ovino) y MSA/TCT (plasma ovino) y MSA/DNasa/TCT (plasma ovino) tuvieron una especificidad absoluta (100%) pero con sensibilidad variable (50%, 25% y 67%, respectivamente).

así, la eficacia de la coagulasa del tubo se puede mejorar con la prueba simultánea que incluya DNase y MSA. Para mayor sensibilidad y especificidad, la identificación de la secuela de Staphylococcus aureus puede comenzar con MSA, DNasa y luego TCT. Cabe destacar que la mejora de la especificidad del TCT no alteró significativamente la alta sensibilidad observada inicialmente., El uso de AMS antes de TCTs/DNasa es altamente recomendado debido al factor de aglutinación negativo y estafilococos coagulasa positivo del tubo que se están recuperando cada vez más de infecciones humanas. Estos aislados también producen una DNasa termoestable y se pueden identificar erróneamente como Staphylococcus aureus. Sin embargo, estas cepas pueden diferenciarse de Staphylococcus aureus por su incapacidad para producir ácido a partir de maltosa, lactosa y manitol. Además, las cepas raras de Staphylococcus aureus pueden ser coagulasa negativa, sin embargo aislados animales (S. intermidius, S. hyicus, S. Delphini y S. schleiferi subsp., coagulans) puede ser coagulasa del tubo positivo ; la diferenciación de éstos también requiere el crecimiento en MSA.

valores predictivos

El crecimiento en la ASM tuvo el mayor valor predictivo negativo (VPN) seguido de la DNasa, mientras que la coagulasa tubular tuvo el menor VPN (que no coincidió con la alta sensibilidad observada inicialmente, Ver Tabla 3). Por el contrario, las combinaciones de pruebas arrojaron un VPN absoluto (100%) con excepción de la DNasa/ASM (VPN del 92%), Tabla 3., Los Altos NPVs de las combinaciones de prueba, particularmente aquellos que involucran el TCT revelan que las combinaciones de prueba pueden ser utilizadas de manera confiable en la identificación rutinaria de Staphylococcus aureus. La DNasa tuvo el mayor valor predictivo positivo (VPP), seguida de la AMS (96% y 83%, respectivamente). Por el contrario, la coagulasa tubular sola produjo Vpp promedio (54% y 50%), Ver Tabla 3. Curiosamente, las combinaciones de pruebas resultaron en VPP altas, siendo las que involucraron DNasa las que tuvieron los Vpp más altos (95%), Ver Tabla 3., Por lo tanto, en cuanto a los VPN, la especificidad del TCT puede mejorarse mediante la identificación simultánea de los aislados con DNasa y MSA.

Por lo tanto, la identificación ideal de aislados clínicos de Staphylococcus aureus requiere una batería de pruebas. Las infecciones por Staphylococcus aureus son más frecuentes que las causadas por otras bacterias, particularmente en entornos con alta prevalencia de VIH/SIDA . Esto justifica la correcta identificación de los aislados para lograr mejores resultados de tratamiento., Dado que se presentan opciones para mejorar la sensibilidad y la especificidad, estos datos mejorarán la identificación de aureus estafilocócico en muestras clínicas.

recomendaciones

para la identificación rutinaria de Staphylococcus aureus a partir de muestras clínicas, recomendamos el uso simultáneo de las tres pruebas (comenzando con el crecimiento en MSA, DNasa y coagulasa tubular) en entornos donde los plasmas de conejo o caballo no están fácilmente disponibles., Se recomienda el cribado de plasmas de otras especies (como conejo, cabra, cerdo y bovino), que pueden ser más baratos y seguros, y reportados como más eficientes que el plasma humano con TCTs. Además, se recomienda el genotipado de aislados clínicos de estafilococos para especializar los aislados de CoNS y para determinar la prevalencia de aislados raros de Staphylococcus aureus y animales en especímenes humanos en Uganda.