Der Oxidase – Test erkennt das Vorhandensein eines Cytochromoxidase-Systems, das den Elektronentransport zwischen Elektronenspendern in den Bakterien und einem Redoxfarbstoff katalysiert-Tetramethyl-p-Phenylen-Diamin. Der Farbstoff ist auf tiefviolette Farbe reduziert., Dieser Test wird verwendet, um bei der Identifizierung von Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella und Pasteurella zu helfen, die alle das Enzym Cytochromoxidase produzieren.

Für diesen Test können mehrere Reagenzien verwendet werden.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismen, die Cytochrom c als Teil ihrer Atmungskette enthalten, sind Oxidase-positiv und machen das Reagenz blau/violett. Organismen, denen Cytochrom c als Teil ihrer Atmungskette fehlt, oxidieren das Reagenz nicht, lassen es innerhalb der Testgrenzen farblos und sind Oxidase-negativ.

Oxidase-positive Bakterien besitzen Cytochromoxidase oder Indophenoloxidase (ein eisenhaltiges Hämoprotein). Beide katalysieren den Transport von Elektronen von Donorverbindungen (NADH) zu Elektronenakzeptoren (üblicherweise Sauerstoff)., Das Testreagenz N, N, N‘, N‘ – Tetramethyl-p-Phenylendiamindihydrochlorid wirkt als künstlicher Elektronenakzeptor für das Enzym Oxidase. Das oxidierte Reagenz bildet die Farbverbindung Indophenolblau.

Das Cytochromsystem ist in der Regel nur in aeroben Organismen vorhanden, die in der Lage sind, Sauerstoff als endgültigen Wasserstoffrezeptor zu nutzen. Das Endprodukt dieses Stoffwechsels ist entweder Wasser oder Wasserstoffperoxid (abgebaut durch Katalase).

Zweck / Verwendung des Oxidase-Tests

• Der Oxidase-Test wird verwendet, um festzustellen, ob ein Organismus das Cytochrom-Oxidase-Enzym besitzt.,
• Der Test dient zur Differenzierung von Neisseria -, Moraxella -, Campylobacter-und Pasteurella-Arten (Oxidase-positiv).
• Es wird auch verwendet, um Pseudomonaden von verwandten Arten zu unterscheiden.

Verfahren des Oxidase-Tests

Es gibt viele Methodenvariationen zum Oxidase-Test. Dazu gehören, sind aber nicht beschränkt auf, die Filterpapier-Test, Direktplatten-Methode, Tupfer-Methode, imprägnierte Oxidase-Teststreifen-Methode und Reagenzglas-Methode. Alle Zeiten und Konzentrationen basieren auf den ursprünglichen Empfehlungen.,

Trockene Filterpapiermethode

Da das Oxidase-Reagenz instabil ist und frisch für den Einsatz vorbereitet werden muss, ist diese Methode praktisch.

1. Streifen des Whatman No. 1 Filterpapiers werden in einer frisch zubereiteten 1% igen Lösung von Tertramethyl-p-Phenylen-Diamin-Dihydrochlorid eingeweicht.
2. Nach etwa 30 Sekunden abtropfen lassen werden die Streifen gefriergetrocknet und in einer dunklen Flasche aufbewahrt, die mit einem Schraubverschluss verschlossen ist.
3. Zur Verwendung wird ein Streifen entfernt, in eine Petrischale gelegt und mit destilliertem Wasser angefeuchtet.,
4. Die zu testende Kolonie wird mit einer Platinschleife aufgenommen und über den feuchten Bereich verschmiert.
5. Eine positive Reaktion wird angezeigt durch einen intensiven tiefvioletten Farbton, der innerhalb von 5-10 Sekunden auftritt, eine „verzögerte positive“ Reaktion durch Färbung in 10-60 Sekunden und eine negative Reaktion durch Abwesenheit von Färbung oder durch Färbung später als 60 Sekunden.

Nassfilterpapiermethode

1. Ein Streifen Filterpapier wird mit etwas frisch hergestellter 1% iger Lösung des Reagens getränkt.
2. Ein Kulturfleck wird mit einer Platinschleife darauf gerieben.,
3. Eine positive Reaktion wird angezeigt durch einen intensiven tiefvioletten Farbton, der innerhalb von 5-10 Sekunden auftritt, eine „verzögerte positive“ Reaktion durch Färbung in 10-60 Sekunden und eine negative Reaktion durch Abwesenheit von Färbung oder durch Färbung später als 60 Sekunden.

Direkte Plattenmethode

1. Fügen Sie 2 -3 Tropfen Reagenz direkt zu verdächtigen Kolonien auf einer Agarplatte hinzu. Überfluten Sie die Platte nicht mit dem Reagenz.
2. Farbwechsel innerhalb von 10 Sekunden beobachten.

Hinweis: Die direkte Plattenmethode sollte auf einer nicht selektiven Agarplatte durchgeführt werden.,

1. Bei Verwendung von Kovacs Oxidase-Reagenz sind Mikroorganismen Oxidase-positiv, wenn sich die Farbe innerhalb von 5 bis 10 Sekunden in dunkelviolett ändert. Mikroorganismen sind verzögert Oxidase positiv, wenn die Farbe innerhalb von 60 bis 90 Sekunden zu lila ändert. Mikroorganismen sind Oxidase negativ, wenn sich die Farbe nicht ändert oder es länger als 2 Minuten dauert.
2. Bei Verwendung von Gordon-und McLeod-Reagenz sind Mikroorganismen oxidase-positiv, wenn sich die Farbe innerhalb von 10 bis 30 Minuten zu Rot oder innerhalb von 60 Minuten zu Schwarz ändert. Mikroorganismen sind Oxidase negativ, wenn sich die Farbe nicht ändert.,

Tupfer Methode

1. Dip tupfer in reagenz und dann touch eine isolierte verdächtige kolonie
2. Beobachten für farbe ändern innerhalb von 10 sekunden.

Reagenzglasmethode

1. Züchten Sie eine frische Bakterienkultur (18 bis 24 Stunden) in 4,5 ml Nährbrühe (oder Standardmedien, die keine hohe Konzentration an Zucker enthalten).
2. Fügen Sie 0,2 ml 1% α-Naphthol hinzu, dann fügen Sie 0,3 ml 1% p-Aminodimethylanilinoxalat (Gaby – und Hadley-Reagenzien) hinzu.
3. Schütteln kräftig zu gewährleisten mischen und gründliche sauerstoffversorgung der kultur.,
4. Auf Farbänderungen achten.
5. Mikroorganismen sind Oxidase-positiv, wenn die Farbe innerhalb von 15 bis 30 Sekunden blau wird. Mikroorganismen sind verzögert Oxidase positiv, wenn die Farbe innerhalb von 2 bis 3 Minuten zu lila ändert. Mikroorganismen sind Oxidase negativ, wenn sich die Farbe nicht ändert.

Ergebnis Interpretation von Oxidase Test

Positive Ergebnis

Entwicklung von eine tiefe lila-blau / blau farbe zeigt oxidase produktion innerhalb von 5-10 sekunden.

Negatives Ergebnis

Keine lila-blaue Farbe/Keine Farbänderung.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Qualitätskontrolle für Oxidase-Test

Positive Kontrolle: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Negative Kontrolle: Escherichia coli ATCC 25922

Einschränkungen des Oxidase-Tests

1. Die im Oxidase-Test verwendeten Reagenzien oxidieren nachweislich automatisch, so dass es sehr wichtig ist, frische Reagenzien zu verwenden, die nicht älter als 1 Woche sind.
2. Sowohl Bakterien als auch Hefe, die auf Medien mit hohen Glukosekonzentrationen gezüchtet wurden, zeigen eine gehemmte Oxidaseaktivität, daher wird empfohlen, Kolonien zu testen, die auf Medien ohne Zuckerüberschuss wie Nährstoff-Agar gezüchtet wurden., Tryptischer Soja-Agar ist auch ein ausgezeichnetes Medium.
3. Bakterien, die auf farbstoffhaltigen Medien gezüchtet werden, können abweichende Ergebnisse liefern.
4. Die Testreagenzien töten die Mikroorganismen effektiv ab, daher sollte die Subkultivierung vor dem Hinzufügen eines Reagens zu einer aktiven Kultur erfolgen.
5. Der Oxidase-Test kann zur mutmaßlichen Identifizierung von Neisseria und zur Differenzierung und Identifizierung gramnegativer Bazillen verwendet werden. Oxidase-positive Organismen sollten von Gram Fleck untersucht werden, um Morphologie und Gram-Reaktion zu bestimmen., Zusätzliche biochemische Tests werden zur vollständigen Identifizierung empfohlen.
6. Die Verwendung einer Nichrom-oder einer anderen eisenhaltigen Schleife kann zu falsch positiven Reaktionen führen. Platinschleifen werden empfohlen.
7. die Meisten Haemophilus sind oxidase-positiv. Weniger empfindliche Streifen oder Reagenzien können falsch negative Ergebnisse liefern.
8. Oxidase-Reaktionen von gramnegativen Bazillen sollten auf nicht selektiven und nicht differentiellen Medien bestimmt werden, um gültige Ergebnisse zu gewährleisten. Kolonien, die aus Medien mit hohem Glukosespiegel entnommen wurden, können auch falsch negative Reaktionen hervorrufen.,
9. Es wird empfohlen, Kolonien zu verwenden, die 18-24 Stunden alt sind. Ältere Kolonien werden schwächere Reaktionen hervorrufen.
10. Alle Farbänderungen, die nach 20 Sekunden auftreten, sollten ignoriert werden.