Abbildung 1. Die Domänenstruktur von MmpA, MmpC und MmpD für die Synthese von Moninsäure. Die Biosynthese von Moninsäure ist nicht kolinear, sondern wurde in diesem Diagramm neu angeordnet. Der Proteinname wird innerhalb des Pfeils mit der unten aufgeführten Modul-und Domänenstruktur angezeigt. ACP=Acylträgerprotein, AT=Acyltransferase, DH=Dehydratase, ER=Enoylreduktase, HMG=3-Hydroxy-3-Methylglutarsäure, MeT=Methyltransferase, KR=Ketoreduktase, KS=Ketosynthase, TE=Thioesterase.,
Abbildung 2. Die Struktur der Pseudomonsäure A-D, markiert A bis D, beziehungsweise.
Abbildung 3. Die C15-Methylgruppe der Moninsäure wird durch das folgende Reaktionsschema an C3 gebunden. MupH ist eine Hydroxymethylglutaryl-Coenzym – A-Synthase, MupJ und MupK sind Enoylcoa-Hydratasen.
Abbildung 4. Der Pyranring von Mupirocin wird in dieser vorgeschlagenen mehrstufigen Reaktion erzeugt., Gen knockouts von mupO, mupU, mupV und macpE abschaffen PA – A Produktion, aber nicht PA-B produktion, was zeigt, dass PA-B ist ein Vorläufer PA-A.
Abbildung 5. MmpB wird vorgeschlagen, 9-HN mit einer 3-Hydroxy-Propionat-Startereinheit und drei Malonyl-CoA-Extender-Einheiten zu synthetisieren. Die Domänenstruktur von MmpB ist unten neben MupE dargestellt, der vorgeschlagenen Enoylreduktase, die für die vollständige Sättigung von 9-HN erforderlich ist. ACP=Acylträgerprotein, DH=Dehydratase, ER=Enoylreduktase, KR=Ketoreduktase, KS=Ketosynthase, TE=Thioesterase.,
Mupirocin ist eine Mischung mehrerer Pseudomonsäuren, wobei Pseudomonsäure A (PA-A) mehr als 90% der Mischung ausmacht. Ebenfalls in Mupirocin vorhanden sind Pseudomonsäure B mit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe bei C8, Pseudomonsäure C mit einer Doppelbindung zwischen C10 und C11 anstelle des Epoxids von PA-A und Pseudomonsäure D mit einer Doppelbindung bei C4` und C5` im 9-Hydroxy-Nonansäure-Anteil von Mupirocin.,
Biosynthese von Pseudomonsäure AEdit
Der 74 kb Mupirocin-Gencluster enthält sechs Multidomänenenzyme und sechsundzwanzig weitere Peptide (Tabelle 1). Es werden vier große Multidomäne-Typ-I-Polyketidsynthase-Proteine (PKS) sowie mehrere Einzelfunktionsenzyme mit Sequenzähnlichkeit zu Typ-II-PKSs codiert. Daher wird angenommen, dass Mupirocin durch ein gemischtes Typ-I-und Typ-II-PKS-System aufgebaut ist. Der Mupirocin-Cluster weist eine atypische Acyltransferase (AT) – Organisation auf, da es nur zwei AT-Domänen gibt und beide auf demselben Protein, MmpC, gefunden werden., Diese AT-Domänen sind die einzigen Domänen, die auf MmpC vorhanden sind, während die anderen drei Typ-I-PKS-Proteine keine AT-Domänen enthalten. Der Mupirocin-Weg enthält auch mehrere Tandem-Acyl-Trägerprotein-Doublets oder Drillinge. Dies kann eine Anpassung sein, um die Durchsatzrate zu erhöhen oder mehrere Substrate gleichzeitig zu binden.
Pseudomonsäure A ist das Produkt einer Veresterung zwischen der 17C-Polyketidmonsäure und der 9C-Fettsäure 9-Hydroxy-Nonansäure., Die Möglichkeit, dass das gesamte Molekül als einzelnes Polyketid mit einer Baeyer-Villiger-Oxidation zusammengesetzt ist, die einen Sauerstoff in das Kohlenstoffrückgrat einführt, wurde ausgeschlossen, da C1 von Moninsäure und C9′ von 9-Hydroxy-Nonansäure beide von C1 von Acetat abgeleitet sind.,
Monic acid biosynthesisEdit
Biosynthesis of the 17C monic acid unit begins on MmpD (Figure 1)., Eine der AT-Domänen von MmpC kann eine aktivierte Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A (CoA) auf die erste ACP-Domäne übertragen. Die Kette wird durch Malonyl-CoA verlängert, gefolgt von einer SAM-abhängigen Methylierung bei C12 (siehe Abbildung 2 für PA-A-Nummerierung) und Reduktion der B-Keto-Gruppe auf einen Alkohol. Es wird vorausgesagt, dass die Dehydrationsdomäne (DH) in Modul 1 aufgrund einer Mutation im konservierten aktiven Standortbereich nicht funktionsfähig ist. Modul 2 fügt weitere zwei Kohlenstoffe durch die Malonyl-CoA-Extender-Einheit hinzu, gefolgt von Ketoreduktion (KR) und Dehydratation., Modul drei fügt eine Malonyl-CoA-Extender-Einheit hinzu, gefolgt von SAM-abhängiger Methylierung bei C8, Ketoreduktion und Dehydratation. Modul 4 erweitert das Molekül um eine Malonyl-CoA-Einheit, gefolgt von einer Ketoreduktion.
Die Montage von Moninsäure wird durch die Übertragung des 12C-Produkts von MmpD auf MmpA fortgesetzt. Zwei weitere Erweiterungsrunden mit Malonyl-CoA-Einheiten werden durch Modul 5 und 6 erreicht. Modul 5 enthält auch eine KR-Domäne.
Post-PKS tailoringEdit
Die Keto-Gruppe bei C3 wird in einer mehrstufigen Reaktion durch eine Methylgruppe ersetzt (Abbildung 3). MupG beginnt mit der Decarboxylierung eines Malonyl-ACP., Der Alpha-Kohlenstoff des resultierenden Acetyl-ACP ist durch MupH mit C3 der Polyketidkette verbunden. Dieses Zwischenprodukt wird durch MupJ bzw. MupK dehydriert und decarboxyliert.
Die Bildung des Pyranrings erfordert viele enzymvermittelte Schritte (Abbildung 4). Die Doppelbindung zwischen C8 und C9 wird vorgeschlagen, zwischen C8 und C16 zu migrieren. Gen-Knockout-Experimente von mupO, mupU, mupV und macpE haben die PA-A-Produktion eliminiert. Die PA-B-Produktion wird durch diese Knockouts nicht entfernt, was zeigt, dass PA-B nicht durch Hydroxylieren von PA-A erzeugt wird., Ein Knockout von mupW eliminierte den Pyranring und identifizierte MupW als an der Ringbildung beteiligt. Es ist nicht bekannt, ob dies vor oder nach der Veresterung von Moninsäure zu 9-Hydroxy-Nonansäure geschieht.
Es wird angenommen, dass das Epoxid von PA-A bei C10-11 nach Pyranbildung durch ein Cytochrom P450 wie MupO eingefügt wird. Ein gen knockout von mupO abgeschafft PA – A produktion aber PA-B, die enthält auch die C10-C11 epoxid, blieb. Dies zeigt an, dass MupO entweder nicht beteiligt ist oder für diesen Epoxidationsschritt nicht wesentlich ist.,
9-Hydroxy-Nonansäure-Biosynthesedit
Die 9-Hydroxy-Nonansäure-Fettsäure (9-HN) wird als separate Verbindung abgeleitet und später zu Moninsäure zu Pseudomonsäure verestert. 13C markierte Acetat-Fütterung hat gezeigt, dass C1-C6 mit Acetat in der kanonischen Art und Weise der Fettsäuresynthese konstruiert sind. C7 ‚zeigt nur die C1-Kennzeichnung von Acetat, während C8′ und C9‘ ein umgekehrtes Muster von 13C-markiertem Acetat zeigen. Es wird spekuliert, dass C7-C9 aus einer 3-Hydroxypropionat-Startereinheit entsteht, die dreimal mit Malonyl-CoA verlängert und vollständig auf 9-HN reduziert wird., Es wurde auch vorgeschlagen, dass 9-HN durch 3-Hydroxy-3-Methylglutarsäure (HMG) initiiert wird. Diese letztere Theorie wurde nicht durch Fütterung von or-HMG unterstützt.
Es wird vorgeschlagen, dass MmpB die Synthese von 9-HN katalysiert (Abbildung 5). MmpB enthält eine KS, KR, DH, 3 ACPs und eine Thioesterase (TE) – Domäne. Es enthält keine Enoylreduktase (ER)-Domäne, die für die vollständige Reduktion auf die Neun-Kohlenstoff-Fettsäure erforderlich wäre. MupE ist ein Single-Domain-Protein, das Sequenzähnlichkeit mit bekannten ER-Domänen aufweist und die Reaktion abschließen kann., Es bleibt auch möglich, dass 9-Hydroxy-Nonansäure teilweise oder vollständig von außerhalb des Mupirocinclusters abgeleitet wird.