die Next generation sequencing (NGS) – Methoden begann zu erscheinen in der Literatur, in der Mitte der 2000er Jahre und hatte einen transformativen Effekt auf unser Verständnis der mikrobiellen Genomik und Infektionskrankheiten. Es gibt jedoch erhebliche Kontroversen darüber, wie, wann und wo die Sequenzierung der nächsten Generation im klinischen Diagnoselabor eine Rolle spielen wird., Eine tiefe Tauchpunkt-Kontrapunkt-Diskussion aus dem Journal of Clinical Microbiology diskutiert die Herausforderungen und Chancen, die mit der Einführung von Metagenomic Next Generation Sequencing (mNGS) in Routinelabors einhergehen können. Was genau ist mNGS und wie unterscheidet es sich von den vielen anderen Nukleinsäuretechnologien da draußen?

Was ist Metagenomische Sequenzierung der Nächsten Generation?

der Sequenzierung der Nächsten generation ist eines von mehreren Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung, wobei Milliarden von Nukleinsäure-Fragmenten können gleichzeitig und unabhängig voneinander sequenziert., Kontrastieren Sie diese Technik mit klassischen Methoden wie der Sanger-Sequenzierung (auch bekannt als Dideoxynukleotid Chain Termination Sequenzierung), die eine Nukleotidsequenz pro Reaktion verarbeitet.
Um ein bakterielles Genom mit NGS zu charakterisieren, wird das Genom beispielsweise in mehrere Fragmente aufgeteilt, die Sequenzen oder Lesevorgänge mit einer Länge von Hunderten bis Zehntausenden von Basen erzeugen. Die Sequenzen werden mithilfe von Rechenansätzen zu einem einzigen Genom zusammengesetzt. Mehrere überlappende Sequenzlesevorgänge werden zusammengefügt, um eine einzelne längere Sequenz namens Contig zu erzeugen., Es gibt oft Lücken zwischen Contigs und obwohl High-Fidelity-längere Sequenz liest die ideale Methode der Sequenzierung wäre, Plattformen, die kürzere Lesevorgänge erzeugen, sind in der Regel weniger kostspielig und die Überlappung in Sequenzen macht sie genauer. Das konstruierte Genom (das wahrscheinlich Lücken enthält) ist zur Identifizierung des Organismus auf eine Referenzdatenbank ausgerichtet. Diese Technologie stellt einen wesentlichen Fortschritt in den frühen Tagen der Sequenzierung dar, wenn ein einzelnes bakterielles Genomprojekt mehrere Jahre dauern könnte.,
Metagenomic NGS (mNGS) läuft einfach alle Nukleinsäuren in einer Probe, die gemischte Populationen von Mikroorganismen enthalten können, und ordnet diese ihren Referenzgenomen zu verstehen, welche Mikroben vorhanden sind und in welchen Anteilen. Die Fähigkeit, Nukleinsäuren aus mehreren verschiedenen Taxa für die metagenomische Analyse zu sequenzieren und zu identifizieren, macht dies zu einer leistungsstarken neuen Plattform, die gleichzeitig genetisches Material aus völlig verschiedenen Organismenreichen identifizieren kann.,

Die möglichen klinischen Anwendungen sind enorm, einschließlich der Diagnose von Infektionskrankheiten, Ausbruch Tracking, Infektionskontrolle Überwachung und Mutation und Pathogen Entdeckung, unter vielen anderen. mNGS, manchmal Shotgun Sequencing genannt, von klinischen Proben wurde auf verschiedene Probentypen einschließlich Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Atemproben, Magen-Darm-Flüssigkeit und Augenflüssigkeit angewendet.

Was sind die Vorteile der metagenomischen Next Generation Sequenzierung?,

Die größte Stärke von mNGS besteht darin, dass es sich um eine unvoreingenommene hypothesenfreie Diagnosemethode handelt, im Gegensatz zu PCR-Methoden (Targeted Polymerase Chain Reaction), die auf Primern zur Identifizierung spezifischer Ziele beruhen, die amplifiziert und nachgewiesen werden sollen. Selbst universelle oder breit angelegte PCR-Methoden sind nicht ausreichend breit, um als metagenomisch angesehen zu werden, da sie spezifische Primer von konservierten 16S-ribosomalen RNA (rRNA) – Genen und internen transkribierten Spacer (ITS) – Sequenzen verwenden, um unterscheidende Nukleinsäuresequenzen zu amplifizieren, die bioinformatisch in Bakterien/Archaeen bzw.,
Universal-Primer stellen auch ein Problem bei der Diagnose von polymikrobiellen Infektionen mit molekularen Tests. Wenn polymikrobielle Populationen vorhanden sind, wenn 16S-Sequenzierung verwendet wird, werden mehrere Basenaufrufe pro Nukleotid durchgeführt, wodurch ein gemischtes Nukleotid-Chromatogramm erzeugt wird, das nicht interpretiert werden kann. Zwar gibt es dekonvolutionelle Berechnungsmethoden zur Vorhersage identifizierter Organismen, Diese werden jedoch für viele Laboratorien nicht standardmäßig verwendet, was häufig zur Sequenzierung des 16S-Gens für polymikrobielle Proben der nächsten Generation führt.,

Was sind die Herausforderungen, die Metagenomische Sequenzierung der Nächsten Generation?

Trotz des Potenzials der mNGS, es gibt viele Hindernisse zu löschen, bevor die Technologie zum Teil des mainstream-Labor, sowie Lücken in unserem Verständnis über Ihre Diagnose-Dienstprogramm. Zu den wichtigsten Vorbehalten zählen die Interpretation der Befunde (Unterscheidung von Kontamination und Besiedlung von echten Krankheitserregern), die Auswahl und Validierung von Datenbanken, die für Analysen verwendet werden, sowie die Vorhersage (oder deren Fehlen) antimikrobieller Anfälligkeiten., Eine allgemeine Wahrnehmung ist, dass mNGS so unglaublich empfindlich ist, dass es eine Diagnose aufdeckt, wenn alle anderen Tests negativ sind. Während mNGS in einigen Fällen analytisch empfindlicher sein können als Standardkultivierungsmethoden, kann die notwendige Entfernung großer Mengen menschlicher Nukleinsäure während der Sequenzierungsvorbereitung und (durch Rechenmethoden) während des postanalytischen Prozesses die Empfindlichkeit im Vergleich zu gezielten PCR-Ansätzen für viele Organismen verringern.

Die Besonderheit von mNGS bleibt der sprichwörtliche Elefant im Raum., Die Kontamination von Proben während der Probenentnahme ist angesichts der erhöhten analytischen Empfindlichkeit von mNGS im Vergleich zu Standardkulturmethoden ein großes Problem, und es muss ein validiertes Qualitätskontrollverfahren für Schritte von der Beurteilung der Reagenzreinheit bis zur Messung angemessener Kontrollen der Genomabdeckung eingerichtet werden. Darüber hinaus können bei einigen Illumina-Plattformen die falschen Barcode-Indizes bezeichnet werden, was zu falsch positiven Sequenzierungsdaten führt., Bioinformatische Qualitätskontrollen sind erforderlich, um sicherzustellen, dass qualitativ hochwertige und validierte Genome mit minimalen Datenbankfehlern verfügbar sind, und idealerweise steht bioinformatisches Personal zur Verfügung, um die Sequenzierungsergebnisse für jeden Test zu interpretieren, der in den meisten klinischen mikrobiologischen Labors nicht verfügbar ist., Die Federal Drug Administration (FDA) hat mit anderen Bundesbehörden zusammengearbeitet, um eine Datenbank mit dem Titel FDA-ARGOS (FDA-Database for Regulatory-grade microbial Sequences) zu kuratieren, die nützlich war, um sicherzustellen, dass die aktuellen mNGS-Ergebnisse zuverlässig und genau sind, aber diese Ressourcen müssen aktualisiert und gepflegt werden.
Die größere Frage bleibt rund um die klinische Spezifität von mNGS: Sind die nachgewiesenen Sequenzen von Krankheitserregern, die auf die aktuelle Krankheit des Patienten beitragen?, Die analytische Spezifität der mNGS-Tests kann mit strengen Kontrollen während der gesamten Probensammlung, Sequenzierung, Vorbereitung, Assaylauf und bioinformatischen Klassifikation angegangen werden, aber die klinische Spezifität wird von diesen Ansätzen nicht direkt angesprochen. Zu den Fragen, die zur Bestimmung des klinischen Nutzens und der Anwendbarkeit beitragen können, gehören: Wie können wir Organismen im Zusammenhang mit vorübergehender Bakteriämie von oraler/gastrointestinaler Flora oder Hautkolonisatoren in Blut – /Plasma-mNGS-Tests unterscheiden?, Wie sollte die Sequenzierungstiefe gemeldet werden und wie zuverlässig ist die Beziehung der Sequenztiefe zur wahren Infektion? Unterscheidet sich diese Beziehung je nach Erreger / Wirt? Wie lange ist die erwartete nachweisbare Halbwertszeit eines Erregers durch mNGS, sobald der Patient eine geeignete kurative Therapie erhält? Studien zum klinischen Nutzen und zur Wirtschaftlichkeit sind trotz der unbestreitbaren Leistungsfähigkeit dieser Technologie aus Forschungs-und Entdeckungsperspektive dringend erforderlich.,
Es ist auch erwähnenswert, dass es derzeit keine von der FDA zugelassenen oder zugelassenen mNGS-Tests gibt, die für mikrobielle Tests gesendet werden können, obwohl es Laboratorien gibt, die nach den Clinical Laboratory Improvement Amendments von 1988 (CLIA ’88) zertifiziert sind und Tests an klinischen Proben anbieten. Bisher wurden nur wenige diagnostische NGS-Systeme von der FDA beispielsweise für onkologische Tests oder den Nachweis von Mukoviszidose zugelassen., Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung beschreibt detailliert viele der regulatorischen Hürden und Überlegungen, die angegangen werden müssen, bevor mNGS als FDA-validierter Test in Mainstream-klinische Diagnoselabors eintreten können.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mNGS-Tests in Zukunft wahrscheinlich eine wichtige Rolle im mikrobiologischen diagnostischen Workflow spielen werden, insbesondere wenn sich die Sequenzierungs-und bioinformatische Verarbeitungsleistung entwickelt, bleibt dies eine hochkomplexe Technologie, für die der klinische Nutzen in unserer aktuellen medizinischen Praxis ungewiss bleibt., Obwohl mNGS-Tests in naher Zukunft neuartige und aufregende klinische Diagnosemöglichkeiten bieten können, wird keines davon wahrscheinlich bald einen klugen Kliniker ersetzen.