Nachdem er von 1992 bis 1995 an der RADA studiert hatte, wurde Macfadyen im britischen Theater vor allem für seine Arbeit mit der Bühnenkompanie Cheek by Jowl bekannt, für die er Antonio in The Duchess of Malfi, Charles Surface in The School for Scandal und Benedick in Much Ado About Nothing spielte. Sein Benedick wurde als Offizier Klasse Trottel mit einem Schnurrbart und einem prahlerischen Lachen gespielt. Im Jahr 2005 spielte er Prinz Hal in Henry IV, Teile Eins und Zwei am Royal National Theatre, mit Michael Gambon in der Rolle des Falstaff., 2007 kehrte er auf die Bühne zurück und porträtierte einen Amerikaner, Clay, einen Vater, der zu Hause blieb, mit einer liberalen Haltung in dem Stück The Pain and the Itch.
Ein TV-Durchbruch kam, als er als Hareton Earnshaw in einer Adaption von Wuthering Heights auftrat, die 1998 im ITV-Netzwerk gezeigt wurde. Weitere Fernsehdramaarbeiten folgten, darunter Hauptrollen in den Dramen Warriors (1999) und The Way We Live Now (2001), beide für die BBC. Ebenfalls 2001 erhielt er Anerkennung für seine Hauptrolle in der BBC Two-Dramaserie Perfect Strangers, die von Stephen Poliakoff geschrieben und inszeniert wurde., Im Jahr 2002 folgte Die Hauptrolle in dem Projekt, eine BBC-drama-charting New Labour ‚ s rise to power. Er spielte in Spooks, was ein Erfolg wurde, als er auf BBC One gezeigt wurde. Eine längere zweite Staffel wurde 2003 gezeigt, und eine dritte Staffel wurde im Herbst 2004 ausgestrahlt, wobei er die Serie in der zweiten Folge verließ. Die Serie wurde als MI-5 im A&E-Netzwerk ausgestrahlt. 2007 trat er in dem einmaligen Channel 4-Drama Secret Life auf, das sich mit dem umstrittenen Thema Pädophilie befasste., Macfadyen gewann für diesen Teil den Best Actor Award bei den Royal Television Society 2007 Awards und wurde für eine BAFTA nominiert. Er erschien auch in einer kurzen Skizze für Comic Relief als Bräutigam in Mr. Beans Hochzeit, neben Rowan Atkinson und Michelle Ryan.
Büste von Mr. Darcy gespielt von Matthew Macfadyen in Stolz & Vorurteil (2005 Film)
Macfadyen erschien in Filmen wie Enigma (veröffentlicht im Jahr 2001), und in der Höhle meines Vaters, für die er den New Zealand Screen Award als bester Schauspieler erhielt., Er spielte als romantische Hauptrolle Fitzwilliam Darcy in einer Adaption von Pride and Prejudice, die im September 2005 in Großbritannien veröffentlicht wurde.
Macfadyen spielte in Frank Oz ‚ Tod bei einer Beerdigung und dem Film Incendiary, basierend auf Chris Cleaves Roman neben Michelle Williams und Ewan McGregor. Er trat auch in Ron Howards Film Frost/Nixon auf, in dem er John Birt spielte. Im Jahr 2008 spielte er die männliche Hauptrolle Arthur Clennam in der BBC-Adaption von Charles Dickens‘ Little Dorrit., Im Jahr 2009 erschien Macfadyen neben der Oscar-nominierten Schauspielerin Helena Bonham Carter im BBC Four-Film Enid, basierend auf dem Leben von Enid Blyton, als Hugh Pollock, Blytons Verleger und erster Ehemann.
2010 spielte er den Sheriff von Nottingham in Robin Hood. Er spielte als Prior Philip in der TV-Serie The Pillars of the Earth, und war der Logan Mountstuart mittleren Alters in jedem menschlichen Herzen. Im Juni 2010 gewann Macfadyen den British Academy Television Award als bester Nebendarsteller für seine Arbeit in der Strafjustiz.,
2011 machte Macfadyen einen letzten Cameo-Auftritt in der BBC-Show Spooks und 2012 spielte er Oblonsky in Joe Wrights Film Anna Karenina. Im Dezember 2012 begann er porträtiert Detective Inspector Edmund Reid, der in BBC One ‚ s Ripper Street.
2013-14 spielte er Jeeves in der Produktion von Jeeves und Wooster in Perfect Nonsense am Duke of York ‚ s Theatre im West End von London. Das Stück gewann 2014 den Olivier Award für die beste neue Komödie.
Im Jahr 2015 nahm Amazon Prime Ripper Street auf und wurde nach guten Kritiken für die vierte und fünfte Staffel wieder aufgelegt., Macfadyen sagte, er sei „erfreut, eine weitere Dosis Ripper Street in Angriff zu nehmen – Blut und Eingeweide, Taschenuhren und viktorianische Kopfbedeckungen, wunderbar dunkel, bewegende und mysteriöse Geschichten von Herrn Richard Wardlow“. Die Serie wurde auch in den USA auf BBC America ausgestrahlt. Auch im Jahr 2015 spielte er Gast in der Pilotfolge von The Last Kingdom.
Derzeit spielt er als Tom Wambsgans in der HBO-Serie Succession, für die er eine Nominierung für den Primetime Emmy Award erhielt.,
2020 trat er in der Rolle des Major Charles Ingram in einem dreiteiligen ITV-Drama Quiz auf, das auf dem umstrittenen Husten-Cheat-Skandal basiert Wer will Millionär im Jahr 2001 sein.