Die genetischen Verbindungen zwischen DNA-Reparaturwegen und der Prädisposition für Krebs beim Menschen haben das Interesse an Proteinen geweckt, die bestimmte Stellen von DNA-Schäden erkennen und reparieren. Die Reparaturenzyme werden bemerkenswert von Bakterien über Pilze bis hin zum Menschen konserviert, was die Prämie unterstreicht, die der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität angesichts einer mutagenen Belastung zukommt., DNA ist anfällig für Schäden, die durch Fehler während der Replikation und durch Umweltfaktoren wie Strahlung, Oxidationsmittel oder Alkylierungsmittel verursacht werden. Reparaturreaktionen beinhalten die Exzision von chemisch veränderten oder falsch paarierten Basen aus dem DNA-Duplex. Resultierende Lücken werden durch DNA-Polymerasen ausgefüllt; Diese Reaktion hinterlässt einen Nick an oder flankiert die Reparaturstelle. Ein analoger Prozess findet während der chromosomalen DNA-Replikation statt, wobei die 5′-RNA-Segmente, die die diskontinuierliche Synthese von Okazaki-Fragmenten ermöglichen, ausgeschnitten und die dazwischenliegenden Lücken durch DNA-Polymerase ausgefüllt werden.,

Die DNA-Reparatur – und Replikationswege konvergieren in einem gemeinsamen letzten Schritt, in dem die Kontinuität des reparierten DNA-Strangs durch DNA-Ligase wiederhergestellt wird, ein Enzym, das Nicks in Phosphodiester-Bindungen umwandelt. Nicks sind potenziell schädliche DNA-Läsionen, die, wenn sie nicht korrigiert werden, zu tödlichen Doppelstrangbrüchen führen können. Dementsprechend ist der Gesamtverlust der DNA-Ligasefunktion tödlich.

DNA-Ligase-Reaktion

DNA-Ligasen katalysieren die Verbindung eines 5′-phosphat-terminierten Strangs mit einem 3′-Hydroxyl-terminierten Strang., Die Ligation hängt von Magnesium und einem energiereichen Cofaktor ab, entweder ATP oder NAD+. Der Reaktionsmechanismus umfasst 3 sequentielle Nukleotidyltransferreaktionen. Im ersten Schritt führt ein nukleophiler Angriff auf den Alpha-Phosphor von ATP (Adenosintriphosphat) oder NAD+ (Nicotinamidadenindinukleotid) durch Ligase zur Freisetzung von Pyrophosphat oder NMN (Nicotinamidmononukleotid) und Bildung eines kovalenten Intermediates (Ligase-Adenylat), in dem AMP über eine Phosphoamid (P-N)-Bindung an die Epsilon-Amino-Gruppe eines Lysins gebunden ist., Im zweiten Schritt wird der AMP auf das 5′-Ende des 5′-Phosphat-terminierten DNA-Strangs übertragen, um DNA-Adenylat zu bilden-eine invertierte Pyrophosphatbrückenstruktur, AppN. Bei dieser Reaktion greift der 5′-Phosphat-Sauerstoff des DNA-Strangs den Phosphor von Ligase-Adenylat an; Die Aktiv-Site-Lysin-Seitenkette ist die Leaving-Gruppe. Im dritten Schritt katalysiert die Ligase den Angriff durch das 3′ – OH des Nickels auf DNA-Adenylat, um sich den 2 Polynukleotiden anzuschließen und AMP freizusetzen.

Phylogenetische Verteilung

Lebende Organismen umfassen 3 Domänen: Eubakterien, Archäabakterien und Eukaryoten., Alle Organismen kodieren 1 oder mehr DNA-Ligasen. Die Ligasen sind in 2 Familien, ATP-abhängige Ligasen und NAD+-abhängige Ligasen, entsprechend dem Nukleotidsubstrat gruppiert, das für die Ligase-Adenylatbildung benötigt wird. ATP-abhängige DNA-Ligasen finden sich in allen 3 Domänen. NAD+ – abhängige DNA-Ligasen (LigA) sind in Bakterien allgegenwärtig, wo sie für das Wachstum unerlässlich sind und attraktive Ziele für die Entdeckung von Antiinfektiva darstellen. NAD+ – abhängige Ligasen treten nur sporadisch außerhalb des bakteriellen Lebensbereichs auf, z.,, in halophilen Archaeen und bestimmten DNA-Viren, und wurden vermutlich in diesen Taxa durch horizontalen Gentransfer erworben.

Eukaryotische zelluläre ATP-abhängige Ligasen

ATP-abhängige DNA-Ligasen finden sich in allen eukaryotischen Spezies. Säugetierzellen enthalten vier DNA-Ligase-Isozyme. Aminosäure-Sequenz-Vergleiche legen nahe, dass eine katalytische Kerndomäne, die allen ATP-abhängigen Ligasen gemeinsam ist, durch zusätzliche isozymspezifische Domänen verschönert wird, die sich an den Amino-oder Carboxyltermini der Proteine befinden., Es wird angenommen, dass diese flankierenden Segmente die Bindung von Säugetier-DNA-Ligasen an andere Proteine vermitteln, die an der DNA-Replikation, – reparatur und-rekombination beteiligt sind. Die Säugetier-Isozyme werden als Ligase I, Ligase IIIa, Ligase IIIb und Ligase IV bezeichnet. DNA-Ligase I ist ein 919-Aminosäure-Polypeptid, das in allen Geweben exprimiert wird und die Verbindung von Okazaki-Fragmenten während der DNA-Replikation katalysiert und auch eine Rolle bei der DNA-Reparatur spielt., DNA-Ligasen IIIa (922 Aminosäuren) und IIIb (862 Aminosäuren) sind die Produkte eines einzelnen Gens; Sie unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz nur an ihren Carboxyltermini als Folge des alternativen mRNA-Spleißens. Ligase IIIa wird ubiquitär exprimiert und ist an der DNA-Reparatur beteiligt und für die Mitochondrienfunktion essentiell. Die Ligase-IIIb-Expression ist auf die Hoden beschränkt, insbesondere auf Spermatozyten, die sich einer Meiose unterziehen. DNA Ligase IV ist ein Aminosäurepolypeptid, das eine Rolle bei der Reparatur von Doppelstrang-DNA-Brüchen über nicht-homologe Endverbindungen (NHEJ) spielt.,

Hefezellen enthalten 2 getrennt kodierte DNA-Ligasen, die homolog zu Säugetier-DNA-Ligasen I bzw. Die DNA-Ligase I (Cdc9p) der aufkeimenden Hefe Saccharomyces cerevisiae ist essentiell für das Zellwachstum. Genetische Experimente implizieren Ligase I beim Versiegeln von Okazaki-Fragmenten und beim Abschluss der DNA-Exzisionsreparatur. Im Gegensatz dazu ist Hefe-DNA-Ligase IV für das Zellwachstum nicht wesentlich. Die Deletion des LIG4-Gens löst jedoch Phänotypen aus, die darauf hinweisen, dass Ligase IV die Reparatur von Doppelstrangbrüchen im nicht homologen Endverbindungsweg (NHEJ) katalysiert., Knospende Hefe hat keinen offensichtlichen Homolog der Säugetier-DNA-Ligase III.

Virale ATP-abhängige DNA-Ligasen

Bakterielle DNA-Viren, wie die E. coli-Bakteriophagen T4, T6, T7 und T3, kodieren ihre eigenen ATP-abhängigen DNA-Ligasen. ATP-abhängige DNA-Ligasen werden auch von eukaryotischen DNA-Viren kodiert, die einen Teil oder den gesamten Replikationszyklus im Zytoplasma durchführen. Dazu gehören Vaccinia-Virus, afrikanische Schweinepest-Virus und Chlorella-Virus PBCV1. Die Bakteriophagen und eukaryotischen viralen DNA-ligasen sind kleiner als Ihre zellulären Gegenstücke., Vaccinia DNA Ligase, ein 552-Aminosäure-Polypeptid, ist auf Aminosäure-Sequenzebene auffallend ähnlich wie Säugetier-DNA-Ligase III. Tatsächlich ist Ligase III enger mit Vaccinia Ligase verwandt als mit Säugetier-Ligasen I und IV. Die Ligasen von T4 (487 Aminosäuren), T7 (359 Aminosäuren), T3 (346 Aminosäuren) und Chlorella-Virus (298 Aminosäuren) sind immer noch kleiner. Wir haben gezeigt, dass die Chlorella-Virus-Ligase das Wachstum eines Hefestamms ergänzen kann, in dem das DNA-Ligase-I-Gen gelöscht wurde., Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Proteinsegmente, die für die viel größere DNA-Ligase I einzigartig sind, für das Wachstum von Hefezellen nicht wesentlich sind.

Nick-Sensing durch DNA-Ligasen

Wir haben die Wechselwirkung von eukaryotischen Ligasen mit DNA anhand von viruskodierten Enzymen als Modelle untersucht. Vaccinia-Virus-DNA-Ligase und Chlorella-Virus-DNA-Ligase bilden jeweils einen diskreten Komplex mit einem einzeln nickten DNA-Liganden in Abwesenheit von Magnesium, der durch native Polyacrylamidgelelektrophorese aus freier DNA aufgelöst werden kann., Die viralen Ligasen bilden keine stabilen Komplexe mit den folgenden Liganden: (i) DNA, die einen 1-Nukleotid-oder 2-Nukleotidspalt enthält; (ii) das versiegelte Duplex-DNA-Produkt der Ligationsreaktion; (iii) ein einzeln nickendes Duplex, das einen 5′ – OH-Terminus am Nick anstelle eines 5′ – Phosphats enthält; oder (iv) ein einzeln nickendes Duplex, das einen RNA-Strang auf der 5′ – Phosphat-Seite des Nick enthält (10 bis 15). Somit haben virale ATP-abhängige DNA-Ligasen eine intrinsische Nick-Sensing-Funktion.,

Die Nickerkennung durch Vaccinia DNA Ligase und Chlorella Virus DNA Ligase hängt auch von der Belegung der AMP-Bindungstasche auf dem Enzym ab-d. H. Mutationen der ligaseaktiven Stelle, die die Fähigkeit zur Bildung des Ligase-Adenylat-Intermediates abschaffen eliminieren auch die Nickerkennung; während eine Mutation, die die Ligase-Adenylat-Bildung beibehält, aber nachgeschaltete Schritte der Strangverbindungsreaktion inaktiviert, keinen Einfluss auf die Bindung an Nicked DNA hat., Die Sequestrierung eines extrahelikalischen Nukleotids durch DNA-gebundene Ligase erinnert an den „Base-Flipping“ – Mechanismus der Erkennung und Katalyse von Zielstellen, der von anderen DNA-Modifizierungs-und Reparaturenzymen verwendet wird.

Obwohl das 5′-Phosphat-Moiety für die Bindung der Chlorella-Virus-Ligase an nickte DNA essentiell ist, ist das 3′ – OH-Moiety für die Nickerkennung nicht erforderlich. Chlorella-Virus-Ligase bindet an einen geknickten Liganden, der 2′, 3′ Dideoxy und 5′-phosphat-Termini enthält, kann aber die Adenylierung des 5′ – Endes nicht katalysieren., Somit ist das 3′-OH für die Schritt-2-Chemie wichtig, auch wenn es während der DNA-Adenylatbildung selbst nicht chemisch transformiert wird.

Um die Ligase-DNA-Schnittstelle abzugrenzen, haben wir die Ligase-Bindungsstelle auf DNA abgedruckt. Die Größe des Exonuklease-III-Fußabdrucks der Ligase, die an einen einzelnen Nick in Duplex-DNA gebunden ist, beträgt 19 bis 21 Nukleotide. Der Fußabdruck ist asymmetrisch und erstreckt sich 8 bis 9 Nukleotide auf der 3′-OH-Seite des Nick und 11 bis 12 Nukleotide auf der 5′-Phosphat-Seite.,

Kristallstruktur der eukaryotischen DNA-Ligase-Adenylat

Chlorella-Virus DNA-Ligase (ChVLig) ist die kleinste bekannte eukaryotische ATP-abhängige Ligase. Als „minimale“ DNA-Ligase stellte sie ein attraktives Ziel für die Strukturbestimmung dar. Wir kristallisierten ChVLig und bestimmten seine Struktur bei 2 Å Auflösung. Das Enzym besteht aus einer größeren N-terminalen Nukleotidyltransferase (NTase)-Domäne und einer kleineren C-terminalen OB-Domäne mit einer Spalte zwischen ihnen. Ein AMP-Moiety wurde kovalent mit Nz von Lys27 an der aktiven Stelle verknüpft., Somit haben wir die Struktur eines echten katalytischen Zwischenprodukts.

Innerhalb der NTase-Domäne befindet sich ein Adenylatbindungssystem, das aus den sechs Peptidmotiven (I, Ia, III, IIIa, IV und V) besteht, die die kovalente Nukleotidyltransferase-Enzym-Superfamilie definieren, die DNA-und RNA-Ligasen und mRNA-Deckelenzyme umfasst. Motiv I (KxDGxR) enthält das Lysin, mit dem AMP im ersten Schritt der Ligasereaktion kovalent verknüpft wird. Aminosäuren in den Motiven Ia, III, IIIa, IV und V kontaktieren AMP und spielen wesentliche Rollen in einem oder mehreren Schritten des Ligationspfades., Die OB-Domäne besteht aus einem fünfsträngigen Antiparallel-Beta-Fass plus einer Alpha-Helix.

Strukturelle Grundlage für die Nickerkennung durch eine minimale „pluripotente“ DNA-Ligase

Obwohl ChVLig die großen N – oder C-terminalen flankierenden Domänen in eukaryotischen zellulären DNA-Ligasen fehlt, kann es das mitotische Wachstum, die DNA-Reparatur und die nichthomologe Endverbindung in Knospenderhefe aufrechterhalten, wenn es die einzige Ligasequelle in der Zelle ist. ChVLig kann sogar die wesentlichen Funktionen der Säugetierlig3 im mitochondrialen DNA-Stoffwechsel erfüllen., Wir schlugen vor, dass ChVLig aufgrund seiner intrinsischen Nick-Sensorfunktion eine abgespeckte „pluripotente“ Ligase darstellt, deren Basis beleuchtet wurde, als wir die 2,3 Å Kristallstruktur von ChVLig-AMP lösten, die an einen 3′-OH/5′-PO4-Nick in Duplex-DNA gebunden war.

ChVLig umgibt die DNA als C-förmige Proteinklemme. Die NTase-Domäne bindet an die gebrochenen und intakten DNA-Stränge in der Hauptnut, die den Nick flankiert, und auch in der Nebennut auf der 3′-OH-Seite des Nick. Die OB-Domäne bindet über die kleine Nut auf dem Gesicht des Duplex hinter dem Nick., Ein neuartiges „Latch“ – Modul-bestehend aus einer Beta-Haarnadel-Schleife, die von der OB – Domäne ausgeht-nimmt die Hauptnut ein und vervollständigt die Umfangsschelle über Kontakte zwischen der Spitze der Schleife und der Oberfläche der NTase-Domäne. Die Verriegelung ist entscheidend für den Klemmverschluss und ist eine wichtige Determinante der Nick-Erfassung.

Der Vergleich der Kristallstrukturen des freien und nickgebundenen ChVLig-AMP zeigt eine große Domain-Neuordnung, die mit der Nickerkennung einhergeht., Im freien ChVLig-AMP wird die OB-Domäne von der NTase-Domäne weg reflektiert, um die DNA-Bindungsoberfläche über der AMP-Bindungstasche vollständig freizulegen. Das Peptidsegment, das zum Riegel bestimmt ist, ist in der freien Ligase ungeordnet und proteolyseempfindlich. Dieses Segment ist jedoch vor Proteolyse geschützt, wenn ChVLig an nickte DNA bindet. Die DNA-Bindung beinhaltet eine fast 180-Drehung der OB-Domäne um einen Wirbel, so dass die konkave Oberfläche des OB-Beta-Fasses in die DNA-Minor-Nut passt., Dieser Übergang löst eine 63 Å-Bewegung der OB-Domäne aus und platziert den Riegel tief in der DNA-Dur-Rille.

Ein Netzwerk von Wechselwirkungen mit den 3′-OH-und 5′ – PO4-Termini an der aktiven Stelle beleuchtete den DNA-Adenylylierungsmechanismus und die kritischen Rollen des AMPS bei der Nick-Sensing und Katalyse. Die Zugabe eines zweiwertigen Kation löste eine Nick-Versiegelung in Crystalo aus, wodurch festgestellt wurde, dass der Nick-Komplex ein gutgläubiges Zwischenprodukt im DNA-Reparaturweg ist.,

Struktur der NAD+ – abhängigen DNA-Ligase, die an nickte DNA-Adenylat gebunden ist

NAD+-abhängige DNA-Ligasen (als LigA bezeichnet) sind eine charakteristische und strukturell homogene Enzymkade, die in allen Bakterien vorkommt. E. coli-LigA (671-aa) ist der Prototyp dieser Familie. LigA hat eine modulare Architektur, die um einen zentralen Ligasekern herum aufgebaut ist, der aus einer NTase-Domäne und einer OB-Domäne besteht. Der Kern wird von einer N-terminalen „Ia“-Domäne und drei C-Terminalmodulen flankiert: einem Tetracystein-Zinkfinger, einer Helix-Haarnadel-Helix-Domäne (HhH) und einer BRCT-Domäne., Jeder Schritt des Ligationspfades hängt von einer anderen Teilmenge der LigA-Domänen ab, wobei nur die NTase-Domäne für alle Schritte erforderlich ist. Domäne Ia ist einzigartig für NAD+ – abhängige Ligasen, ist verantwortlich für die Bindung der NMN-Sättigung von NAD+ und ist für die Reaktion mit NAD+ erforderlich, um das Ligase-AMP-Intermediat zu bilden.

Wir fanden heraus, dass die NAD+-abhängige E. coli-DNA-Ligase das Wachstum von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen unterstützen kann, die einzeln für CDC9 oder doppelt für CDC9 plus LIG4 gelöscht wurden., Dies ist die erste Demonstration, dass ein NAD+ – abhängiges Enzym in einem eukaryotischen Organismus biologisch aktiv ist. Nachfolgende Studien (in Zusammenarbeit mit Maria Jasin) zeigten, dass E. coli LigA für die Ligasefunktion in Maus-ES-Zellen ohne das essentielle Lig3-Enzym ausreichen könnte.

Unsere an das Nicked DNA-adenylate intermediate gebundene Kristallstruktur der E. coli LigA zeigte, dass die LigA auch die DNA-Helix als C-förmige Proteinklemme umgibt. Die Protein-DNA-Schnittstelle beinhaltet umfangreiche DNA-Kontakte durch die NTase -, OB-und HhH-Domänen über ein 19-bp-Segment von Duplex-DNA, das um den Nick zentriert ist., Die NTase-Domäne bindet an die gebrochenen DNA-Stränge an und flankiert den Nick, Die OB-Domäne kontaktiert den kontinuierlichen Schablonenstrang, der den Nick umgibt, und die HhH-Domäne bindet beide Stränge über die kleine Nut an der Peripherie des Fußabdrucks. Das Zn-Finger-Modul spielt eine strukturelle Rolle bei der Überbrückung der OB-und HhH-Domänen. Domäne Ia macht keine Kontakte zum DNA-Duplex, im Einklang mit seiner Dispensierbarkeit für die Katalyse des Strangverschlusses auf einem AppDNA-Substrat.,

Die LigA-NTase-und OB-Domänen sind ähnlich auf dem DNA-Umfang wie die NTase-und OB-Domänen der ATP-abhängigen DNA-Ligasen positioniert und „zeichnen“ ähnliche Segmente der DNA-Stränge. Die Topologie der Ligaklemme unterscheidet sich jedoch stark von den Klammern, die von ChVLig und der humanen DNA-Ligase 1 gebildet werden (HuLig1, bestimmt von Tom Ellenberger und Kollegen). Die ersten Kontakte, die die Ligaklemme schließen, sind sui generis, die die NTase-Domäne und die C-Terminal-HhH-Domäne betreffen., Basierend auf verfügbaren Strukturdaten ist es klar, dass DNA-Ligasen mindestens drei verschiedene Mittel zur Umkreisung von DNA entwickelt haben.

Vergleiche des E. coli LigA-AppDNA-Komplexes mit Strukturen anderer bakterieller Ligasen, die als binärer LigA•—NAD+—Komplex (Substrat Schritt 1), binärer LigA•-NMN-Komplex (Gruppe nach dem Verlassen Schritt 1) und kovalentes Ligase-AMP-Intermediat (Produkt Schritt 1 nach dem Verlassen der Gruppen Dissoziation) erfasst wurden, heben massive Proteindomänenumlagerungen (in der Größenordnung von 50 bis 90 Å) hervor, die synchron mit Substratbindung und Katalyse auftreten., DNA-Bindung und Klemmbildung durch LigA bringt eine fast 180 Rotation der OB-Domäne mit sich, so dass die konkave Oberfläche des OB-Beta-Fasses in die Minor-Nut passt, ähnlich dem, was für ChVLig und HuLig1 gesehen oder abgeleitet wird. Die Vierpunktbindung der HhH-Domäne an der Peripherie des LigA-DNA-Fußabdrucks stabilisiert eine DNA-Biegung, die am Nick zentriert ist. Die LigA-DNA-Interaktionen, die den Nick sofort flankieren, induzieren eine lokale DNA-Verzerrung, was zur Annahme einer RNA-ähnlichen A-Form-Helix führt, die wiederum die Ergebnisse für das HuLig1-DNA-Cocrystal widerspiegelt.,

Mechanismus der Lysin-Adenylylierung durch ATP-abhängige und NAD+ – abhängige Polynukleotidligasen

Die Auto-Adenylylierungsreaktion von Polynukleotidligasen erfolgt durch eine Nukleotidyltransferase (NTase)-Domäne, die in ATP-abhängigen DNA-und RNA-Ligasen und NAD+ – abhängigen DNA-Ligasen konserviert ist. Die NTase-Domäne umfasst die Definition von Peptidmotiven, die die nukleotidbindende Tasche bilden. Motiv I (KxDG) enthält das Lysin, das kovalent an den AMP gebunden wird. Wie Robert Lehman 1974 betonte, ist unklar, wie Lysin (mit einem vorhergesagten pKa-Wert von ~10.,5) verliert sein Proton bei physiologischem pH-Wert, um den nicht protonierten Zustand zu erreichen, der für den Angriff auf den α-Phosphor von ATP oder NAD+erforderlich ist. Im Prinzip könnte Ligase eine allgemeine Basis verwenden, um das Lysin zu deprotonieren. Alternativ könnte das pKa durch das positive Ladungspotential von Proteinaminosäuren, die Lysin-Nz umgeben, heruntergefahren werden. Mehrere Kristallstrukturen von Ligasen und Metallen lieferten kaum Unterstützung für beide Erklärungen. In diesen Strukturen befindet sich das Motiv-I-Lysin-Nucleophile neben einer Motiv-IV-Glutamat – oder Aspartat-Seitenkette., Das Lysin und das Motiv IV Carboxylat bilden ein Ionenpaar, dessen erwartete Wirkung darin besteht, die pKa von Lysin aufgrund der umgebenden negativen Ladung zu erhöhen. Es ist unwahrscheinlich, dass ein Glutamat-oder Aspartatanion als Basis dienen könnte, um ein Proton aus dem Lysin-Kation zu abstrahieren. Eine mögliche Lösung für das Problem wäre, wenn ein zweiwertiges Kation die Lysin-Nz anstößt und seine pKa herunterfährt.,

Ein metallgetriebener Mechanismus wurde durch unsere jüngste Kristallstruktur der Naegleria gruberi-RNA-Ligase (NgrRvl) als Michaelis-Komplex von Schritt 1 mit ATP und Mangan (seinem bevorzugten Metallkofaktor) aufgedeckt. Der Schlüssel zur Erfassung des Michaelis – ähnlichen Komplexes war der Ersatz des Lysin-Nukleophils durch ein isosterisches Methionin. Die 1,9 Å-Struktur enthielt ATP und zwei Manganionen an der aktiven Stelle. Das „katalytische“ Metall wurde mit der oktaedrischen Geometrie auf fünf Gewässer abgestimmt, die wiederum durch die Carboxylatseitenketten konservierter Rückstände in den Motiven I, III und IV koordiniert wurden., Die sechste Ligandenstelle im katalytischen Metallkomplex war mit einem ATP-α-Phosphat-Sauerstoff besetzt, was auf eine Rolle des Metalls bei der Stabilisierung des Übergangszustands der Autoadenylylierungsreaktion hinweist. Eine wichtige Erkenntnis, verstärkt durch die Überlagerung des Michaelis-Komplexes auf die Struktur des kovalenten NgrRrl-(Lys–Nz)-AMP-Intermediates, betraf die Rolle des katalytischen Metallkomplexes bei der Stabilisierung des nicht protonierten Zustands des Lysinnukleophils vor der Katalyse über lokale positive Ladung und atomaren Kontakt von Lys-Nz zu einem von metallgebundenen Gewässern., Der NgrRnl Michaelis-Komplex zeigte ein zweites Metall, das oktaederal mit vier Gewässern und ATP-β-und γ-Phosphat-Oxygenen koordiniert war. Der Metallkomplex und das ATP-γ-Phosphat wurden von einem Ensemble von Aminosäureseitenketten (einzigartig für NgrRll) in Anspruch genommen, die gemeinsam die PPi-Abgangsgruppe apikal an das Lysin-Nukleophile ausrichten. In Übereinstimmung mit einem einstufigen Inline-Mechanismus wurde das α-Phosphat während des Übergangs vom NgrRll•ATP Michaelis–Komplex zum Lysyl-AMP-Intermediat stereochemisch invertiert., Es wird angenommen, dass sich DNA-Ligasen getrennt von RNA-Ligasen entwickelt haben, zunächst durch Fusion einer angestammten ATP-nutzenden NTase-Domäne mit einer C-terminalen OB-Domäne (um den minimalen katalytischen Kern einer DNA-Ligase zu umfassen) und anschließend durch Fusion zusätzlicher Strukturmodule mit dem NTase-OB-Kern (7). NAD+ – abhängige DNA-Ligasen (Ligaenzyme), die in Bakterien allgegenwärtig und für die bakterielle Lebensfähigkeit essentiell sind, erlangten ihre Spezifität für NAD+ durch Fusion eines NMN-bindenden Ia-Domänenmoduls mit dem N-Terminus der NTase-Domäne., Escherichia coli DNA ligase (EcoLigA) war die erste zelluläre DNA-Ligase, die entdeckt und charakterisiert wurde und bleibt das führende Modell für strukturelle und funktionelle Studien der NAD+ – abhängigen DNA-Ligasefamilie. Das Interesse am Ligamechanismus wird durch das Versprechen angetrieben, LigA (über seine Signaturspezifität des NAD+-Substrats und einzigartige strukturelle Merkmale gegenüber menschlichen DNA-Ligasen) für die Entdeckung antibakterieller Arzneimittel anzuvisieren.

Wir haben eine 1,55 Å Kristallstruktur von EcoLigA als Michaelis Komplex mit NAD+ und Magnesium gelöst., Die Struktur zeigt einen Ein-Metall-Mechanismus, bei dem ein Ligase-gebundener Mg2+(H2O)5-Komplex den Lysin-pKa senkt und das NAD+ α-Phosphat einnimmt, aber das β-Phosphat und das Nicotinamid-Nukleosid der NMN-5-Gruppe sind ausschließlich über atomare Wechselwirkungen mit Proteinelementen ausgerichtet, die für die Ligaklade einzigartig sind. Die Zwei-Metall (für ATP-abhängige Ligase) versus Ein-Metall (für NAD+ – abhängige Ligase) Dichotomie grenzt einen Verzweigungspunkt in der Ligaseentwicklung ab.