Allgemeine Transkriptionsfaktoren und Initiierung der Transkription durch RNA-Polymerase II

Da RNA-Polymerase II für die Synthese von mRNA aus proteinkodierenden Genen verantwortlich ist, stand es im Mittelpunkt der meisten Studien zur Transkription in Eukaryoten. Frühe Versuche, dieses Enzym zu untersuchen, zeigten, dass sich seine Aktivität von der der prokaryotischen RNA-Polymerase unterscheidet., Die genaue Transkription von Bakteriengenen, die in vitro einfach durch Zugabe von gereinigter RNA-Polymerase zu DNA, die einen Promotor enthält, erreicht werden kann, ist in eukaryotischen Systemen nicht möglich. Die Grundlage für diesen Unterschied wurde 1979 aufgeklärt, als Robert Roeder und seine Kollegen entdeckten, dass RNA-Polymerase II die Transkription nur initiieren kann, wenn der Reaktion zusätzliche Proteine zugesetzt werden. Daher schien die Transkription im eukaryotischen System unterschiedliche Initiationsfaktoren zu erfordern, die (im Gegensatz zu bakteriellen Initiationsfaktoren) nicht mit der Polymerase assoziiert waren.,

Die biochemische Fraktionierung von Kernextrakten hat nun zur Identifizierung spezifischer Proteine (sogenannte Transkriptionsfaktoren) geführt, die für die Initiierung der Transkription der RNA-Polymerase II erforderlich sind. In der Tat stellt die Identifizierung und Charakterisierung dieser Faktoren einen großen Teil der laufenden Bemühungen dar, die Transkription in eukaryotischen Zellen zu verstehen. Es wurden zwei allgemeine Arten von Transkriptionsfaktoren definiert. Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind an der Transkription von allen Polymerase-II-Promotoren beteiligt und stellen daher einen Teil der grundlegenden Transkriptionsmaschinerie dar., Zusätzliche Transkriptionsfaktoren (später im Kapitel diskutiert) binden an DNA-Sequenzen, die die Expression einzelner Gene steuern und somit für die Regulierung der Genexpression verantwortlich sind.

Für die Initiierung der Transkription durch RNA-Polymerase II in rekonstituierten In-vitro-Systemen sind fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren erforderlich (Abbildung 6.12). Die Promotoren vieler durch Polymerase II transkribierter Gene enthalten eine Sequenz ähnlich TATAA 25 bis 30 Nukleotiden stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle., Diese Sequenz (TATA-Box genannt) ähnelt dem Hauptsequenzelement bakterieller Promotoren, und die Ergebnisse der Einführung von Mutationen in TATAA-Sequenzen haben ihre Rolle bei der Initiierung der Transkription gezeigt. Der erste Schritt bei der Bildung eines Transkriptionskomplexes ist die Bindung eines allgemeinen Transkriptionsfaktors namens TFIID an die TATA-Box (TF zeigt Transkriptionsfaktor an; II zeigt Polymerase II an)., TFIID selbst besteht aus mehreren Untereinheiten, einschließlich des TATA-bindenden Proteins (TBP), das spezifisch an die TATAA-Konsenssequenz bindet, und 10-12 anderen Polypeptiden, die als TBP-assoziierte Faktoren (TAFs) bezeichnet werden. TBP bindet dann einen zweiten allgemeinen Transkriptionsfaktor (TFIIB), der am Promotor einen TBP-TFIIB-Komplex bildet (Abbildung 6.13). TFIIB wiederum dient als Brücke zur RNA-Polymerase, die in Verbindung mit einem dritten Faktor, TFIIF, an den TBP-TFIIB-Komplex bindet.

Nach Rekrutierung der RNA-Polymerase II an den Promotor ist die Bindung von zwei zusätzlichen Faktoren (TFIIE und TFIIH) für die Einleitung der Transkription erforderlich. TFIIH ist ein Multisubunit-Faktor, der mindestens zwei wichtige Rollen zu spielen scheint. Erstens sind zwei Untereinheiten von TFIIH Helicasen, die DNA um die Initiationsstelle abwickeln können. (Diese Untereinheiten von TFIIH sind auch für die Nukleotid-Exzisionsreparatur erforderlich, wie in Kapitel 5 diskutiert.,) Eine weitere Untereinheit von TFIIH ist eine Proteinkinase, die wiederholte Sequenzen phosphoryliert, die in der C-terminalen Domäne der größten Untereinheit der RNA-Polymerase II vorhanden sind.Es wird angenommen, dass die Phosphorylierung dieser Sequenzen die Polymerase aus ihrer Assoziation mit dem Initiationskomplex freisetzt, so dass sie entlang der Schablone fortfahren kann, während sie die wachsende RNA-Kette verlängert.

Zusätzlich zu einer TATA-Box enthalten die Promotoren vieler durch RNA-Polymerase II transkribierter Gene ein zweites wichtiges Sequenzelement (eine Initiator-oder Inr-Sequenz), das die Transkriptionsstartstelle überspannt., Darüber hinaus enthalten einige RNA-Polymerase-II-Promotoren nur ein Inr-Element ohne TATA-Box. Die Initiierung an diesen Promotoren erfordert immer noch TFIID (und TBP), obwohl TBP diese Promotoren offensichtlich nicht durch direkte Bindung an die TATA-Sequenz erkennt. Stattdessen scheinen andere Untereinheiten von TFIID (TAFs) an die Inr-Sequenzen zu binden. Diese Bindung rekrutiert TBP an den Promotor, und TFIIB, Polymerase II und zusätzliche Transkriptionsfaktoren montieren dann wie bereits beschrieben. TBP spielt somit eine zentrale Rolle bei der Initiierung der Polymerase-II-Transkription, selbst bei Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt.,

Trotz der Entwicklung von In-vitro-Systemen und der Charakterisierung mehrerer allgemeiner Transkriptionsfaktoren bleibt noch viel über den Mechanismus der Polymerase-II-Transkription in eukaryotischen Zellen zu lernen. Die hier beschriebene sequentielle Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren stellt das minimale System dar, das für die Transkription in vitro erforderlich ist; Zusätzliche Faktoren können innerhalb der Zelle benötigt werden. Darüber hinaus scheint die RNA-Polymerase II in der Lage zu sein, einige Transkriptionsfaktoren in vivo zu assoziieren, bevor ein Transkriptionskomplex auf DNA aufgebaut wird., Insbesondere wurden vorgeformte Komplexe der RNA-Polymerase II mit TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH und anderen transkriptionellen regulatorischen Proteinen sowohl in Hefe-als auch in Säugetierzellen nachgewiesen. Diese großen Komplexe (Polymerase-II-Holoenzyme genannt) können über direkte Wechselwirkung mit TFIID zu einem Promotor rekrutiert werden (Abbildung 6.14). Die relativen Beiträge der schrittweisen Anordnung einzelner Faktoren gegenüber der Rekrutierung des RNA-Polymerase-II-Holoenzyms zu Promotoren innerhalb der Zelle bleiben somit zu bestimmen.