Entwurf des synthetischen Acetyl-CoA-Weges

Der einfachste Weg, organischen Kohlenstoff aus einem Kohlenstoff zu synthetisieren, besteht darin, ihn einzeln zu konstruieren., Um aus einem Kohlenstoff einen künstlichen Acetyl-CoA-Weg aufzubauen, schlugen wir den synthetischen Acetyl-CoA-Weg (SACA) vor, bei dem zwei Moleküle Formaldehyd in nur drei Schritten in ein Molekül Acetyl-CoA übertragen würden (Abb. 1a). Erstens würde Formaldehyd durch die Glykolaldehydsynthase (GALS) zu Glykolaldehyd (GALD) kondensiert. Und dann würde Glykolaldehyd durch die Acetylphosphatsynthase (ACPS) unter Verwendung von anorganischem Phosphat in Acetylphosphat (AcP) umgewandelt. Schließlich würde AcP zur Herstellung von Acetyl-CoA durch das bekannte Enzym Phosphatacetyltransferase (PTA)25 verwendet., In der Zwischenzeit kann Formaldehyd erhalten werden, indem Kohlendioxid und Formate26 reduziert oder Methan und Methanol27 oxidiert werden. So konnten wir die Biosynthese von Acetyl-CoA aus Formaldehyd und sogar anderen Kohlenstoffressourcen realisieren.

Die Thermodynamik kann widerspiegeln, ob ein Weg effektiv in vivo oder in vitro. Wir berechneten die thermodynamische chemische Antriebskraft des entworfenen SACA-Weges., Die Gesamtreaktion von Formaldehyd zu Acetyl-CoA ist hoch thermodynamisch günstig, wobei die gesamte Gibbs−Energiewende (ΔrG ‚ m) der gesamten Reaktion etwa -96,7 kJ mol-1 beträgt (Abb. 1b und Ergänzende Tabelle 1). Der Wert von MDF (Maximum Driving Force) wird üblicherweise verwendet, um die thermodynamische und kinetische Qualität verschiedener Pathways28 zu bewerten. Wenn der MDF ausreichend hoch ist, enthält der Weg keine thermodynamischen Engpässe, die seinen Betrieb in vivo behindern würden. Der SACA-Weg erhielt den relativ hohen MDF-Wert von 26.,9 kJ mol-1, was offensichtlich höher ist als die FLS−und MCC-Pfade (ihre MDF-Werte sind 1,9 bzw. Daher ist der SACA-Weg thermodynamisch günstig für die Biosynthese von Acetyl-CoA aus Formaldehyd.

Identifizierung eines neuen Enzyms von C1 bis C2

Die Kondensation von Formaldehyd kann durch den N-heterocyclischen Karabiner in der Chemiestruktur katalysieren29,30. In der Biologie hat der Thiazoliumring des Cofaktors Thiamindiphosphat (ThDP) eine ähnliche Funktion, die einen Aldehyd aktivieren und dann mit einem anderen Aldehyde Dimer bilden könnt31., Um ein Enzym zu finden, um zwei Moleküle Formaldehyd zu einem Molekül Glykolaldehyd zu kondensieren, haben wir auf die katalytischen Mechanismen von ThDP-abhängigen Enzymen verwiesen und ein Theozymmodell konstruiert, das ThDP, Glykolaldehyd und Glutaminsäure enthält, die Elektronen für die Reaktion bereitstellen32 (Abb. 2a). Alle Enzyme in der Protein Data Bank (PDB) wurden basierend auf dem Theozym-Modell virtuell gescreent und 37 nicht redundante Proteinstrukturen mit Ligand ThDP wurden erreicht (Ergänzende Abb. 1 und ergänzender Hinweis)., Nach den katalytischen Mechanismen von ThDP-abhängigen Enzymen33, 34, 35, C2 Atom in ThDP ist das aktive Zentrum. Der Abstand zwischen C2-Atom und dem Produkt aus Glykolaldehyd ist entscheidend für die Auslösung der katalytischen Reaktion (Abb. 2a). So analysierten wir den Abstand zwischen C2-Atom und Glykolaldehyd in jedem Kandidatenprotein.

Basierend auf den durchschnittlichen Distanzen in jedem Protein unter Verwendung molekularer Methoden (ergänzende Daten 1)36 wurden sechs Kandidaten mit kurzen Distanzen und klaren funktionellen Anmerkungen als Kandidaten definiert (Abb. 2b und Ergänzende Tabelle 2). Zusätzlich wurden drei Proteine mit langen Distanzen zufällig als Kontrollen ausgewählt. Die Kandidaten und Kontrollen wurden exprimiert und gereinigt, um ihre Fähigkeit zu testen, Glykolaldehyd aus Formaldehyd zu produzieren., Drei von sechs Kandidaten zeigten die gewünschte Aktivität, während drei Kontrollen die Funktion nicht hatten, was darauf hinweist, dass der Abstand zwischen C2-Atom und Glykolaldehyd eine kritische Rolle bei der Kondensation von Formaldehyd spielt. Unter drei aktiven Kandidaten wurde berichtet, dass das Protein 2UZ1 (), das als Benzaldehydlyase (BAL) bezeichnet wurde, trotz der minimalen Ausbeute an Glykolaldehyd bevorzugt Dihydroxyaceton (DHA) erzeugt, wenn die Konzentration von Formaldehyd niedriger war37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

Gerichtete Entwicklung der Glykolaldehydsynthase

Da BAL zur Herstellung von DHA aus Formaldehyde22 entwickelt worden war, schlugen wir vor, nachzuweisen, ob die entsprechenden Mutationen in BFD auch zur Verbesserung der Enzymaktivität beitragen würden (Ergänzende Abb. 2). Durch das Screening aller mutierten Rückstände fanden wir tatsächlich eine hochaktive Mutation W86R-N87T, die sich im Substratkanal von BFD befand (Ergänzende Abb. 3). Somit wurde diese Mutation (W86R-N87T) in BFD eingeführt und die Variante wurde als M1 markiert., Um die katalytische Aktivität von BFD weiter zu verbessern, schlugen wir vor, alle Rückstände um das aktive Zentrum von BFD zu sieben, wobei 25 Positionen innerhalb von 8 Å Abstand vom aktiven Zentrum ausgewählt wurden, um eine Einpunkt-Sättigungsmutagenese durchzuführen (Ergänzende Abb. 4). Wir entwickelten einen Hochdurchsatz-Screening-Ansatz zum Nachweis von Glykolaldehyd durch Farbreaktion zwischen Glykolaldehyd und Diphenylamin, der mittels spektrophotometrischer Überwachung bei 650 nm gemessen wurde (Ergänzende Abb. 5)., Nach dem Screening stellten wir fest, dass 14 von 25 Positionen höhere Aktivitäten aufwiesen als M1-Mutanten (Ergänzende Abb. 6). Anschließend 14 Positionen waren aufgeteilt in 8 Gruppen: Eine (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), und H (T379/T380). N27 wurde dreimal verwendet, da die Varianten in dieser Position die höchste Aktivität zeigten. Unter Verwendung von M1 als Vorlage führten wir jede Gruppe von Mutationen in M1 ein und wählten die höchste aktive Mutante aus, die als M2 gekennzeichnet war., Durch die Durchführung von drei Runden iterativer kombinatorischer Mutagenese zwischen diesen Positionen haben wir 64.512 Klone vollständig gescreent und eine Mutante mit hoher Aktivität erhalten, die fünf neuartige Mutationen um das aktive Zentrum enthält. Schließlich wurde die Variante mit 7 Rückstandsmutationen als Glykolaldehydsynthase (GALS) bezeichnet. Die kcat von GALS wurde um das 160-fache verbessert und die endgültige katalytische Effizienz von GALS beträgt 9,6 M-1·s-1, was ungefähr 70-fach höher ist als das Ausgangsenzym (Abb. 3a und Ergänzende Abb. 7).

Um herauszufinden, wie diese Mutationen die Enzymaktivität verbessern, haben wir vorgeschlagen, die Kristallisation von GALS zu wiederholen. Die aktive Tasche befindet sich an der Schnittstelle des Homodimers von GALS38., Die Proteinstruktur von GALS kann sich nach mehreren Mutationsrunden vom Ausgangsprotein unterscheiden. Hier kristallisierten wir das Protein von GALS und holten die Kristallstruktur von GALS unter Verwendung der Struktur von BFD als Suchmodell ab (Ergänzende Tabelle 3). Die Kristallstruktur von GALS wurde analysiert (Ergänzende Abb. 8, Ergänzende Abb. 9). Wir fanden heraus, dass die Mutation von L110E zwei zusätzliche Wasserstoffbrücken in die Hydroxylgruppe des Zwischenanalogs (IMA) einführt, die zur Stabilisierung des Übergangszustands und zur Spaltung der C–C-Bindung zwischen Produkt und Cofaktor ThDP beitragen können (Abb. 3b)., Die Mutation von L109G vergrößerte das Volumen der Substratbindungstasche, indem die große Isobutylgruppe durch eine Wasserstoffgruppe ersetzt wurde. Die dritte Mutation von A460M kann das Substrat neu ausrichten und dann die Wechselwirkung zwischen ThDP und Substrat verstärken. Die letzten beiden Mutationen H281V und Q282F erweiterten den Porenradius der Außenfläche und können den Zugang für Substrat oder Produkt erleichtern (Abb. 3c). Im Vergleich zu M1 wurde das Volumen der Reaktionstasche in GALS um mehr als 30% vergrößert, was der Hauptgrund für die Verbesserung der katalytischen Aktivität sein würde.,

Identifizierung der Acetyl-Phosphat-Synthase

In der Natur wurde kein Enzym berichtet, um die Synthese von AcP aus Glykolaldehyd zu erreichen. Phosphoketolasen (PKs) können AcP aus Fructose-6-Phosphat (F6P)oder Xylulose-5-Phosphat (X5P) produzieren 39. Gemäß dem katalytischen Mechanismus von PKs ist es möglich, dass Glykolaldehyd mit ThDP interagiert und dann 2-α,β-Dihydroxyethyliden-ThDP (DHEThDP) erzeugt (Abb. 4a), welches das Schlüsselintermediat der Bildung von AcP aus F6P oder X5P durch PKs ist. Um unsere Hypothese zu bestätigen, haben wir acht Kandidaten ausgewählt (Abb., 4b) basierend auf dem phylogenetischen Baum von PKs aus 111 Bakterienfamilien (Ergänzende Abb. 10). Nach Gensynthese und Proteinreinigung (Ergänzende Abb. 11) untersuchten wir die katalytische Aktivität aller Kandidatenproteine unter Verwendung von Glykolaldehyd als Substrat. Glücklicherweise zeigten fünf von acht PKs signifikante katalytische Aktivitäten. Nur PK1, PK4 und PK8 zeigten keinen signifikanten Unterschied zum Leerzeichen. So wurde PK2 mit der höchsten Aktivität als Acetylphosphat-Synthase (ACPS) bezeichnet, deren kcat/Km 3,21 M−1·s−1 erreicht (Ergänzende Abb. 12).,

Um den Mechanismus der Bildung von DHEThDP aus Glykolaldehyd aufzudecken, schlugen wir vor, eine theoretische Analyse basierend auf dem vorherigen Rechenmodell von PK40 durchzuführen. Alle möglichen Aminosäuren, die mit der Bildung von DHEThDP zusammenhängen, wurden verwendet, um das Rechenmodell zu konstruieren (Ergänzende Abb. 13)., Basierend auf einer Computersimulation fanden wir heraus, dass die Energiebarriere nur 11,36 kcal mol−1 für die Bildung von IM1 (Zwischenprodukt 1) beträgt, wenn Glykolaldehyd von His553 protoniert wurde, was als der bestmögliche Protonenspender angesehen wurde40 (Abb. 4c). Dann tautomerisiert IM1 mit Hilfe von Glu479 und Glu437 in IM2. IM2 ist energetisch stabiler als IM1. Wenn das Proton von IM2 von N4′ in ThDP abgezogen wurde, ist die Energiebarriere von IM2 zum Schlüsselzwischenprodukt DHEThDP 15.,13 kcal mol-1, das der Dehnungsenergie während der Bildung von DHEThDP unter Verwendung von F6P als Substrat40 so ähnlich ist. Nach der Bildung von DHEThDP sind die folgenden katalytischen Prozesse die gleichen wie andere PKs (Ergänzende Abb. 14), d. H. H97 fungiert als Protonenspender des Dehydratisierungsprozesses von DHEThDP, und Sein Blut und Gly155 beschleunigen den Dehydratisierungsprozess von DHEThDP, ausgehend von der Tatsache, dass His142 und Gly155 Wasserstoffbindungen mit dem Wassermolekül bilden Struktur des Post-Dehydratisierungszwischens (AcThDP)., His64, Tyr501 und Asn549 sind wichtig für den nukleophilen Angriff von Pi und bilden zusammen die Bindungsstelle von Pi39. Standortgerichtete Mutageneseexperimente zeigten auch, dass diese Rückstände für die Enzymaktivität von entscheidender Bedeutung sind (Ergänzende Abb. 15).

Synthese von Acetyl-CoA aus Formaldehyd in vitro

Mit dem anfänglich erfolgreichen Design von GALS und ACPS beabsichtigten wir, den SACA-Weg in vitro zur Synthese von Acetyl-CoA aus Formaldehyd zu konstruieren. Erstens haben wir die Ausbeute an Glykolaldehyd durch GALS unter verschiedenen Konzentrationen von Formaldehyd gemessen., Die Ergebnisse zeigten, dass GALS die Dimerisierung von Formaldehyd effektiv katalysieren kann und die Ausbeute an Glykolaldehyd mit verbesserter Substratkonzentration zunimmt (Abb. 5a). Beispielsweise stieg die Ausbeute an Glykolaldehyd aus Formaldehyd von 45% bei 0,5 g L-1 auf 80% bei 2 g L−1. Zweitens untersuchten wir die katalytische Effizienz von Glykolaldehyd zu AcP, die durch den Gehalt an Essigsäure quantifiziert wurde, da AcP schnell zu Essigsäure abgebaut würde (Ergänzende Abb. 16)23., Die Ergebnisse zeigten, dass die Ausbeute an AcP bei unterschiedlichen Glykolaldehydkonzentrationen über ACPS mehr als 80% erreichte (Ergänzende Abb. 17). Leider wurde ACPS offensichtlich durch Formaldehyd gehemmt (Abb. 5b). Daher ist es notwendig, ein Gleichgewicht für die Konzentration von Formaldehyd bei der Lösung dieses Konflikts zu finden.

Um die Konzentration von Formaldehyd zu optimieren, wurde ein Gradientenexperiment unter Verwendung des Reaktionssystems durchgeführt, das 2 mg ml−1 von GALS und ACPS enthält. Mit zunehmender Formaldehydkonzentration nahm die Ausbeute an Essigsäure im System zunächst zu und nahm dann ab (Abb. 5c). Wenn die Konzentration von Formaldehyd 1 g L-1 beträgt, erreichte die Ausbeute an Essigsäure 50,6%., Interessanterweise ist die Endausbeute an Essigsäure sogar höher als die im Reaktionssystem von Glykolaldehyd zu AcP mit der gleichen Menge Formaldehyd (Abb. 5b, graue Linie). Dies würde durch die teilweise Freisetzung der Funktion von ACPS verursacht werden, da Formaldehyd allmählich von MÄDELS verbraucht wurde. Basierend auf diesem System fügten wir ein weiteres bekanntes Enzymphosphat Acetyltransferase (PTA) hinzu, das AcP in Acetyl-CoA umwandeln würde. Schließlich produzierte der SACA-Weg 5,5 mM Acetyl-CoA bei der Formaldehydkonzentration von 1 g L-1. Die Ausbeute an Acetyl-CoA aus Formaldehyd betrug etwa 33% (Abb. 5d)., Die Ausbeute an Essigsäure (7,8 mM) aus Formaldehyd (33,3 mM) erreichte jedoch 50%, wenn PTA und CoA nicht zugeführt wurden. Die geringere Ausbeute an Acetyl-CoA als die von Essigsäure würde durch die Instabilität von Acetyl-CoA und AcP verursacht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass es für die Biosynthese von Acetyl-CoA aus Formaldehyd durch den SACA-Weg in vitro erfolgreich ist.,

Validierung des SACA-Weges durch 13C-Kennzeichnung

Nach der Bestimmung des SACA-Weges mit gereinigten Enzymen in vitro haben wir weiter versucht, die Biosynthese von Acetyl-CoA und dessen Derivaten aus dem SACA-Weg in vivo durch 13C-Metabolic-Tracer-Assays zu testen (Abb. 6a). Erstens wurden Zelllysate verwendet, um die Biosynthese von Acetyl-CoA durch Zugabe von 13C-markiertem Formaldehyd und CoA zu überprüfen. Wir haben einen signifikanten Anstieg des doppelten 13C-markierten Acetyl-CoA als bei anderen Kontrollen festgestellt (P-Wert < 0.001, T-Test) (Abb. 6b und Ergänzende Abb. 18)., Darüber hinaus verschwand der Anstieg von doppeltem 13C-markiertem Acetyl-CoA, wenn wir eines der Gene im SACA-Weg wie ACPS und PTA wegließen (Ergänzende Abb. 19). Zusätzlich würde Acetyl-CoA mit Oxaloacetat konvergiert, um in den Tricarbonsäure-Zyklus (TCA) einzutreten. Wir haben auch signifikant mehr doppeltes 13C-markiertes Fumarat (P-Wert < 0.001, T-Test) und Malat (P-Wert < 0.001, T-Test) nur im Stamm mit dem SACA-Weg und 13C-markierter Formaldehydzufuhr (Abb. 6b und Ergänzende Abb. 18)., Wir haben jedoch keine signifikanten Unterschiede in Isotopomeren höherer Ordnung festgestellt. Es würde durch die geringe Menge an doppelt 13C-markierten Isotopomeren im TCA-Zyklus verursacht werden.

Anschließend schlugen wir vor, den Kohlenstofffluss innerhalb von Zellen zu testen. Aufgrund der Toxizität von Formaldehyd für Zellen führten wir die Methanoldehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 ein, um eine kontinuierlich niedrige Formaldehydkonzentration in vivo aufrechtzuerhalten (Abb. 6a). Die kultivierten Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und zum Nachweis proteinogener Aminosäuren und intrazellulärer Metaboliten verwendet (Abb. 6c)., Wir fanden heraus, dass der Stamm mit dem SACA-Weg (BsMDH-SACA) mehr doppeltes 13C-markiertes Aspartat und Glutamat enthielt, das aus dem TCA-Zyklus stammte. Darüber hinaus wurden die 13C-markierte Glucose und Phosphoenolpyruvat, die aus doppeltem 13C-markiertem Oxaloacetat durch den Gluconeogeneseweg erzeugt werden könnten, im Stamm BsMDH-SACA stärker nachgewiesen als im Kontrollstamm (BsMDH-28a). Daher zeigten unsere Ergebnisse, dass der SACA-Weg für die Herstellung von Acetyl-CoA-und Acetyl-CoA-abgeleiteten Metaboliten aus Formaldehyd funktionell ist.,

Bewertung des SACA-Weges durch Zellwachstum

Um den SACA-Weg in vivo weiter zu bewerten, schlugen wir vor, das Zellwachstum schrittweise zu testen, indem wir jedes Intermediat in den Weg einspeisten. Anfangs wuchs E. coli unter dem reichen Medium auf und dann wurde Glykolaldehyd als zusätzliche Kohlenstoffquelle hinzugefügt. Durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von Glykolaldehyd (Ergänzende Abb. 20), fanden wir heraus, dass der engineered Stamm, der den SACA-Weg mit mehr als 0 enthält.,die 4 g L−1 Glykolaldehydzufuhr weist einen deutlich höheren OD600 auf als jene Stämme ohne Glykolaldehyd oder den SACA-Weg (Abb. 7a und Ergänzende Abb. 21). Der Beitrag von Glykolaldehyd zur Biomasse (Zelltrockengewicht, CDW) betrug 0,681 ± 0,028 gCDWg−1 (n = 3) Glykolaldehyd.

Als wir das Zellwachstum mit Formaldehyd als ergänzender Kohlenstoffquelle testeten, wurde das Wachstum des Stammes mit leerem Vektor vollständig durch 80 mg L−1 Formaldehyd gehemmt (Abb. 7b). Der Stamm, der den SACA-Weg enthielt, wurde zunächst gehemmt und wuchs dann normal unter der gleichen Bedingung auf, was durch seine schnellere Formaldehydaufnahme als der Stamm mit leerem Vektor verursacht werden kann (Ergänzende Abb. 22)., Leider hatte der Stamm, der den SACA-Weg enthielt, nicht mehr Biomasse mit Formaldehydzusatz als solche ohne Formaldehyd. Diese Ergebnisse zeigten, dass der SACA-Weg zwar effizienter ist, um das toxische Formaldehyd zu entfernen, aber nicht ausreicht, um Biomasse bereitzustellen.

Schließlich wollten wir den SACA-Weg durch Zuführung von Methanol bewerten, das kontinuierlich in Formaldehyd umgewandelt würde. Wir fanden heraus, dass der Stamm, der sowohl den BsMDH-als auch den SACA-Weg enthält, einen höheren OD600 aufweist als die Kontrollen ohne Methanolzufuhr oder den SACA-Weg (Abb. 7c und Ergänzende Abb., 23). Nach 26 h Inkubation fanden wir heraus, dass der Wert von OD600 in dem Stamm, der sowohl den BsMDH-als auch den SACA-Weg enthielt, um 0,2 anstieg, was signifikant höher ist als der Stamm ohne den SACA-Weg (P-Wert = 0,005, T-Test). Beim Vergleich mit dem Stamm ohne den SACA-Weg fanden wir heraus, dass die Menge an Biomasse, die aus Methanol gewonnen wurde, 0,03 ± 0,006 gCDW g−1 (n = 3) Methanol in dem Stamm war, der den SACA-Weg enthält.