ingeniería de proteínas y análisis de mecanismos de la glicolaldehído sintasa. a parámetros cinéticos de WT y mutantes. WT: tipo salvaje; M1: mutaciones en W86R y N87T; M2: mutaciones en W86R, N87T, L109G y L110E; M3: mutaciones en W86R, N87T, L109G, L110E y A460M; M4: mutaciones en W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V, y Q282F. B descripción general de las cinco mutaciones seleccionadas en el centro activo. IMA: análogo intermedio; las líneas anaranjadas indican los enlaces de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de IMA y la mutación L110E., C los volúmenes de bolsillo de M1, M2, M3 y M4. Los puntos rosados representan los volúmenes de las bolsas de unión (datos complementarios 2), que son 131.25, 161.50, 133.38 y 171.38 Å3, respectivamente. Las figuras fueron renderizadas usando el software UCSF Chimera versión 1.1246. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

para averiguar cómo estas mutaciones mejoran la actividad enzimática, propusimos rehacer la cristalización de GALS. El bolsillo activo se localiza en la interfaz del homodímero de GALS38., La estructura proteica de las GALS puede diferir de la proteína inicial después de varias rondas de mutación. Aquí, cristalizamos la proteína de GALS y recuperamos la estructura cristalina de GALS usando la estructura de BFD como modelo de búsqueda (tabla suplementaria 3). Se analizó la estructura cristalina de las GALS (suplemento Fig. 8, Suplemento Fig. 9). Encontramos que la mutación de L110E introduce dos enlaces de hidrógeno adicionales al grupo hidroxilo del análogo intermedio (IMA), que pueden contribuir en la estabilización del Estado de transición y la escisión del enlace C–C entre el producto y el cofactor ThDP (Fig. 3b)., La mutación de L109G amplió el volumen de la bolsa de unión del sustrato al reemplazar el grupo isobutilo grande con un grupo de hidrógeno. La tercera mutación de A460M puede reorientar el sustrato y luego mejorar la interacción entre ThDP y el sustrato. Las dos últimas mutaciones H281V y Q282F expandieron el radio de poros de la superficie exterior y pueden facilitar el acceso para sustrato o producto (Fig. 3c). En comparación con M1, el volumen de la bolsa de reacción en GALS se agrandó más del 30%, lo que sería la razón principal para la mejora de la actividad catalítica.,

identificación de la acetil-fosfato sintasa

en la naturaleza, no se reportó ninguna enzima para lograr la síntesis de AcP a partir de glicolaldehído. Las fosfocetolasas (PKs) pueden producir AcP a partir de fructosa-6-fosfato (F6P) o xilulosa-5-fosfato (X5P)39. De acuerdo con el mecanismo catalítico de PKs, es posible que el glicolaldehído interactúe con ThDP y luego genere 2-α,β-dihidroxietilideno-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), que es el intermediario clave para formar AcP a partir de F6P o X5P por PKs. Para confirmar nuestra hipótesis, seleccionamos ocho candidatos (Fig., 4b)basado en el árbol filogenético de PKs de 111 familias de bacterias (suplemento Fig. 10). Después de la síntesis génica y purificación de proteínas (suplemento Fig. 11), se examinó la actividad catalítica de todas las proteínas candidatas utilizando glicolaldehído como sustrato. Afortunadamente, cinco de cada ocho PK mostraron actividades catalíticas significativas. Solo las PK1, PK4 y PK8 no mostraron diferencias significativas con respecto al control en blanco. Así, PK2 con la actividad más alta se denominó como acetil-fosfato sintasa (ACPS), cuyo kcat/Km alcanza a 3.21 m−1·s−1 (Suplemento Fig. 12).,

análisis computacional e identificación funcional de la acetil-fosfato sintasa. a la formación de DHEThDP a partir de F6P / X5P y glicolaldehído. Las flechas sólidas representan el mecanismo de formación de DHEThDP en ref. 39; las flechas punteadas indican el proceso predicho usando glicolaldehído como sustrato. B La identificación de los ACP. El árbol filogenético de máxima verosimilitud de los ocho PKs seleccionados fue construido por MEGA47., Los detalles de los PK seleccionados están presentes en la nota complementaria y en la Fig. 10. La actividad de cada proteína se detectó mediante la adición de 0,5 mg mL−1 enzima y 10 mM de glicolaldehído. AcP acetil fosfato, PK fosfocetolasa, producción de AcP (µmol min-1 mg-1): la cantidad de AcP producida por mg de enzima por minuto; Control: no se añadió ninguna enzima en el sistema de reacción; las barras de Error representan s. d. (desviación estándar), n = 3. C el perfil energético para el proceso de formación de DHEThDP., IM1 e IM2 representan el intermedio 1 y 2 durante el proceso de formación; TIM representa el intermedio tautomerizado entre IM1 e IM2; TS1 y TS2 representan los estados de Transición. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

para revelar el mecanismo de formación de DHEThDP a partir de glicolaldehído, se propuso realizar un análisis teórico basado en el modelo computacional anterior de PK40. Se utilizaron todos los aminoácidos posibles relacionados con la formación de DHEThDP para construir el modelo computacional (suplemento Fig. 13)., Con base en la simulación computacional, encontramos que la barrera de energía es de solo 11,36 kcal mol−1 para la formación de IM1 (Intermedio 1) cuando el glicolaldehído fue protonado por His553, que fue considerado como el donor de protones más posible 40 (Fig. 4c). Luego, IM1 se tautomeriza en IM2 con la ayuda de Glu479 y Glu437. El IM2 es energéticamente más estable que el IM1. Cuando el protón de IM2 fue despojado por N4′ en ThDP, la barrera de energía de IM2 al dhethdp intermedio clave es 15.,13 kcal mol-1, que es tan similar como la energía de deformación durante la formación de DHEThDP utilizando F6P como sustrato 40. Después de la formación de DHEThDP, los siguientes procesos catalíticos son los mismos que otros PKs (suplemento Fig. 14), es decir, H97 actúa como donante de protones del proceso de deshidratación de DHEThDP, y His142 y Gly155 aceleran el proceso de deshidratación de DHEThDP, a juzgar por el hecho de que His142 y Gly155 forman enlaces de hidrógeno con la molécula de agua en la estructura del intermedio post-deshidratación (AcThDP)., His64, Tyr501 y Asn549 son importantes para el ataque nucleofílico de Pi y juntos forman el sitio de unión de Pi39. Los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio también indicaron que estos residuos son fundamentales para la actividad enzimática (suplemento Fig. 15).

síntesis de acetil-CoA a partir de formaldehído in vitro

con el exitoso diseño inicial de GALS y ACPS, pretendimos construir la vía SACA in vitro para sintetizar acetil-CoA a partir de formaldehído. En primer lugar, medimos el rendimiento de glicolaldehído por GALS bajo diferentes concentraciones de formaldehído., Los resultados mostraron que las GALS pueden catalizar eficazmente la dimerización del formaldehído, y el rendimiento de glicolaldehído aumentó con la concentración de sustrato mejorada (Fig. 5a). Por ejemplo, el rendimiento de glicolaldehído del formaldehído aumentó de 45% a 0.5 g L−1 a 80% a 2 g L−1. En segundo lugar, examinamos la eficiencia catalítica de glicolaldehído a AcP, que se cuantificó por el contenido de ácido acético, ya que AcP se degradaría rápidamente en ácido acético (Fig. 16)23., Los resultados mostraron que el rendimiento de AcP alcanzó más del 80% bajo diferentes concentraciones de glicolaldehído a través de ACPS (suplemento Fig. 17). Desafortunadamente, el ACPS fue obviamente inhibido por el formaldehído (Fig. 5b). Por lo tanto, es necesario tomar un equilibrio para la concentración de formaldehído en la resolución de este conflicto.

confirmando la biosíntesis de acetil-CoA a partir de formaldehído por la vía SACA in vitro. a la síntesis de glicolaldehído a partir de formaldehído por GALS., Las reacciones se ejecutaron bajo diferentes concentraciones de formaldehído con 2 mg mL−1 purificados GALS a 37 ° C durante 2 h. b la inhibición de ACPS por formaldehído. Los rendimientos de ácido acético se midieron en diferentes momentos con tampón de reacción, 2 mg mL−1 ACPS, 0,75 g L−1 glicolaldehído y el gradiente de formaldehído de 0 a 2 g L-1 que fue representado por diferentes líneas de color. C rendimiento de ácido acético a partir de diferentes concentraciones de formaldehído. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 ° C durante la noche con tampón de reacción, 2 mg mL−1 GALS, 2 mg mL−1 ACPS y el gradiente de formaldehído de 0.,5 a 2 g L-1. D rendimiento de ácido acético o acetil-CoA a partir de 1 g L−1 formaldehído. Los rendimientos de ácido acético o acetil-CoA se midieron en diferentes momentos. La línea azul representa el sistema de reacción para producir acetil-CoA (con alimentación de 20 mM de CoA y que contiene 2 mg mL−1 de las GALS purificadas, ACPS y PTA, respectivamente); la línea naranja representa el sistema de reacción para producir ácido acético (que contiene 2 mg mL−1 GALS y ACPS y sin alimentación de CoA). Las muestras en todos los ensayos fueron analizadas por HPLC. Las barras de Error representan s. d. (desviación estándar), n = 3., Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

con el fin de optimizar la concentración de formaldehído, se realizó un experimento de gradiente utilizando el sistema de reacción que contiene 2 mg mL−1 de GALS y ACPS. Al aumentar la concentración de formaldehído, el rendimiento de ácido acético en el sistema aumentó inicialmente y luego disminuyó (Fig. 5c). Cuando la concentración de formaldehído es de 1 g L-1, el rendimiento de ácido acético alcanzó el 50,6%., Curiosamente, el rendimiento final de ácido acético es incluso mayor que en el sistema de reacción de glicolaldehído a AcP con la misma cantidad de formaldehído (Fig. 5b, línea gris). Esto sería causado por la liberación parcial de la función de los ACPS ya que el formaldehído fue consumido gradualmente por las chicas. Basándonos en este sistema, añadimos otra enzima conocida como fosfato acetiltransferasa (PTA), que convertiría a AcP en acetil-CoA. Finalmente, la vía SACA produjo acetil-CoA de 5,5 mM a la concentración de formaldehído de 1 g L-1. El rendimiento de acetil-CoA del formaldehído fue de alrededor del 33% (Fig. 5d)., Sin embargo, el rendimiento de ácido acético (7,8 mM) del formaldehído (33,3 mM) alcanzó el 50% si no se suministraba PTA y CoA. El menor rendimiento de acetil-CoA que el del ácido acético sería causado por la inestabilidad de acetil-CoA y AcP. Nuestros resultados indicaron que es exitoso para la biosíntesis de acetil-CoA a partir de formaldehído por la vía SACA in vitro.,

validación de la vía SACA mediante etiquetado con 13C

después de determinar la vía SACA con enzimas purificadas in vitro, intentamos probar la biosíntesis de acetil-CoA y sus derivados de la vía SACA in vivo mediante ensayos de trazador metabólico con 13C (Fig. 6a). En primer lugar, se utilizaron LISADOS celulares para verificar la biosíntesis de acetil-CoA mediante la adición de formaldehído marcado con 13C y CoA. Se detectó un aumento significativo del acetil-CoA marcado con 13C doble que otros controles (valor p < 0.001, prueba T) (Fig. 6b y suplemento Fig. 18)., Además, el aumento de la acetil-CoA marcada con doble 13C desaparecía si se omitiera uno de los genes de la vía SACA, como el ACPS y el PTA (suplemento Fig. 19). Además, el acetil-CoA convergería con el oxaloacetato para entrar en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). También detectamos significativamente más fumarato doble marcado con 13C (valor p < 0.001, t-test) y malato (valor p < 0.001, t-test) solo en la cepa con la vía SACA y alimentación de formaldehído marcado con 13C (Fig. 6b y suplemento Fig. 18)., Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en los isotopómeros de masa de orden superior. Sería causada por la baja cantidad de isotopómeros marcados con 13C dobles en el ciclo de TCA.

análisis de trazador metabólico marcado con 13C de la vía SACA. un diagrama esquemático de la vía probada para el trazador marcado con 13C. B fracción de compuestos m + 2 en LISADOS celulares con formaldehído marcado o no marcado con 13C. C fracción de metabolitos marcados con 13C., Las células fueron inducidas en LB y transferidas al medio M9 que contenía metanol marcado con 13C. Los metabolitos intracelulares se detectaron después de 16 h de incubación y los aminoácidos proteinogénicos se midieron después de 26 h de incubación. La suma de los isotopómeros detectados se fijó en 100%., 13C-FALD 13C-etiquetado formaldehído, m + 0 sin 13C etiquetado, M + 1 solo 13C etiquetado, m + 2 doble 13C etiquetado, FALD formaldehído, MeOH metanol, gald glicolaldehído, AcP acetil-fosfato, Asp ASP, Glu glutamato, Pep fosfoenolpiruvato, SACA la cepa contiene el vector GALS-ACPS-PTA-28a, 28A la cepa contiene el vector vacío de 28A, BsMDH-SACA el la cepa contiene ambos vectores bsmdh-PCDF y Gals-ACPS-PTA-28a, bsmdh-28a: la cepa contiene ambos vectores bsmdh-PCDF y el vector vacío 28a. las barras de error representan s. d. (desviación estándar), n = 3., Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

posteriormente, propusimos probar el flujo de carbono dentro de las células. Debido a la toxicidad del formaldehído para las células, se introdujo la metanol deshidrogenasa de Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 para mantener una concentración continuamente baja de formaldehído in vivo (Fig. 6a). Las células cultivadas se cosecharon en diferentes momentos y se utilizaron para detectar aminoácidos proteinogénicos y metabolitos intracelulares (Fig. 6c)., Encontramos que la cepa con la vía SACA (BSMDH-SACA) contenía más aspartato doble marcado con 13C y glutamato, que derivaban del ciclo de TCA. Además, la glucosa marcada con 13C y el fosfoenolpiruvato, que podrían generarse a partir del oxaloacetato marcado con 13C doble a través de la vía de la gluconeogénesis, se detectaron más en la cepa BSMDH-SACA que en la cepa control (BsMDH-28a). Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que la vía SACA es funcional para producir acetil-CoA y metabolitos derivados de acetil-CoA a partir de formaldehído.,

evaluación de la vía SACA por crecimiento celular

con el fin de evaluar aún más la vía SACA in vivo, se propuso probar el crecimiento celular paso a paso mediante la alimentación de cada Intermedio en la vía. Inicialmente E. coli creció bajo el medio rico y luego se añadió glicolaldehído como fuente suplementaria de carbono. Mediante la adición de diferentes concentraciones de glicolaldehído (suplemento Fig. 20), encontramos que la cepa de ingeniería que contiene la vía SACA con más de 0.,El suministro de 4 g L−1 de glicolaldehído tiene una OD600 notablemente mayor que aquellas cepas sin glicolaldehído o la vía SACA (Fig. 7a y suplemento Fig. 21). La contribución del glicolaldehído a la biomasa (peso seco celular, CDW) fue de 0.681 ± 0.028 gcdwg−1 (n = 3) glicolaldehído.

evaluación de la vía SACA por crecimiento celular. un ensayo de crecimiento celular utiliza 0.4 g L−1 glicolaldehído como fuente suplementaria de carbono., ensayos de crecimiento de células b utilizando 80 mg de formaldehído L-1 como fuente suplementaria de carbono. ensayos de crecimiento de células c utilizando 8 g L−1 de metanol como fuente suplementaria de carbono. Las células inicialmente se cultivaron en medio LB. Se agregó IPTG Para inducir la expresión de proteínas y luego se agregaron las fuentes suplementarias de carbono. OD600 se detectó en diferentes momentos., SACA la cepa contiene el vector GALS-ACPS-PTA-28A, 28A la cepa contiene el vector vacío de 28A, BSMDH-SACA la cepa incluye ambos vectores BSMDH-pCDF y GALS-ACPS-PTA-28A, BsMDH-28A la cepa contiene ambos vectores bsmdh-pCDF y el vector vacío 28a, no GALS la cepa contiene todos los genes en la vía excepto GALS, + adición de fuente de carbono suplementaria, − sin fuente de carbono suplementaria, glicolaldehído (GALD), formaldehído (fald), metanol (MeOH). Las barras de Error representan s. d. (desviación estándar), n = 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.,

cuando probamos el crecimiento celular usando formaldehído como fuente de carbono suplementario, el crecimiento de la cepa con vector vacío fue totalmente inhibido por 80 mg L−1 de formaldehído (Fig. 7b). La cepa que contiene la vía SACA fue inhibida inicialmente y luego creció normalmente en las mismas condiciones, lo que puede ser causado por su tasa más rápida de consumo de formaldehído que la cepa con vector vacío (suplemento Fig. 22)., Desafortunadamente, la cepa que contiene la vía SACA no tenía más biomasa con suplemento de formaldehído que aquellas sin formaldehído. Estos resultados indicaron que aunque la vía SACA es más eficiente para eliminar el formaldehído tóxico, no es suficiente para proporcionar biomasa.

Por último, se pretendía evaluar la vía SACA mediante la alimentación de metanol, que se convertiría continuamente en formaldehído. Encontramos que la cepa que contiene tanto la vía BSMDH como la vía SACA tiene mayor OD600 que los controles sin suministro de metanol o la vía SACA (Fig. 7C y suplemento Fig., 23). Después de 26 h de incubación, encontramos que el valor de OD600 en la cepa que contiene tanto la vía BSMDH como la vía SACA aumentó alrededor de 0.2, que es significativamente mayor que la cepa sin la vía SACA (valor de P = 0.005, prueba T). Al comparar con la cepa sin la vía SACA, encontramos que la cantidad de biomasa derivada del metanol fue de 0.03 ± 0.006 gcdw G−1 (n = 3) metanol en la cepa que contiene la vía SACA.