oxidastestet detekterar närvaron av ett cytokrom oxidassystem som katalyserar transporten av elektroner mellan elektrondonatorer i bakterierna och ett redoxfärgämne – tetrametyl-p-fenylendiamin. Färgen reduceras till djup lila färg., Detta test används för att hjälpa till vid identifiering av Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella och Pasteurella, alla som producerar enzymet cytokrom oxidas.

ett antal reagenser kan användas för detta test.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismer som innehåller Cytokrom c som en del av deras andningskedja är oxidaspositiva och vrider reagenset blått/lila. Organismer som saknar cytokrom C som en del av deras andningskedja oxiderar inte reagenset, lämnar det färglöst inom testets gränser och är oxidasnegativa.

oxidaspositiva bakterier har cytokrom oxidas eller indofenoloxidas (ett järn innehållande hemoprotein). Båda dessa katalyserar transporten av elektroner från donatorföreningar (NADH) till elektronmottagare (vanligtvis syre)., Testreagensen, N, n, n’, n’-tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid fungerar som en artificiell elektronacceptor för enzymoxidas. Det oxiderade reagenset bildar den färgade föreningen indofenolblå.

cytokromsystemet förekommer vanligen endast i aeroba organismer som kan använda syre som den slutliga vätereceptorn. Slutprodukten av denna metabolism är antingen vatten eller väteperoxid (uppdelad i katalas).

syfte/användning av Oxidastest

• oxidastestet används för att avgöra om en organism har cytokrom oxidasenzymet.,
• testet används som ett hjälpmedel för differentiering av arter av Neisseria, Moraxella, Campylobacter och Pasteurella (oxidaspositiva).
• Det används också för att skilja pseudomonader från relaterade arter.

förfarande för Oxidastest

det finns många metodvariationer till oxidastestet. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, filterpapper test, direkt platta metod, Pinn metod, impregnerade oxidas testremsa metod och provrör metod. Alla tider och koncentrationer baseras på de ursprungliga rekommendationerna.,

torr Filterpappersmetod

eftersom oxidasreagensen är instabil och måste vara nyberedd för användning är den här metoden bekväm.

1. remsa av Whatmans nr 1 filterpapper blötläggs i en nyberedd 1% lösning av tertrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid.
2. efter tömning i ca 30 sekunder fryses remsorna och förvaras i en mörk flaska tätt förseglad med ett skruvlock.
3. för användning avlägsnas en remsa, läggs i en petriskål och fuktas med destillerat vatten.,
4. kolonin som ska testas plockas upp med en platinaslinga och smutsas över det fuktiga området.
5. en positiv reaktion indikeras av en intensiv djuplila nyans, som uppträder inom 5-10 sekunder, en ”fördröjd positiv” reaktion genom färgning på 10-60 sekunder och en negativ reaktion genom frånvaro av färgning eller genom färgning senare än 60 sekunder.

våt Filterpappersmetod

1. en remsa av filterpapper blötläggs med lite nygjord 1% lösning av reagenset.
2. en fläck av kultur gnids på den med en platinaslinga.,
3. en positiv reaktion indikeras av en intensiv djuplila nyans, som uppträder inom 5-10 sekunder, en ”fördröjd positiv” reaktion genom färgning på 10-60 sekunder och en negativ reaktion genom frånvaro av färgning eller genom färgning senare än 60 sekunder.

metod för direkt platta

1. tillsätt 2 -3 droppar reagens direkt till misstänkta kolonier på en agarplatta. Fyll inte plattan med reagenset.
2. Observera för färgförändring inom 10 sekunder.

Obs! metoden för Direktplåtar bör utföras på en icke-selektiv agarplatta.,

1. när Kovacs oxidasreagens används är mikroorganismerna oxidaspositiva när färgen ändras till mörklila inom 5 till 10 sekunder. Mikroorganismer fördröjs oxidas positivt när färgen ändras till lila inom 60 till 90 sekunder. Mikroorganismer är oxidasnegativa om färgen inte ändras eller det tar längre tid än 2 minuter.
2. vid användning av Gordon och McLeod-reagens är mikroorganismerna oxidaspositiva när färgen ändras till rött inom 10 till 30 minuter eller till svart inom 60 minuter. Mikroorganismer är oxidas negativa om färgen inte ändras.,

Swab metod

1. doppa pinnen i reagens och sedan röra en isolerad misstänkt koloni
2. Observera för färgförändring inom 10 sekunder.

Provrörsmetoden

1. odla en ny kultur (18 till 24 timmar) av bakterier i 4,5 ml näringsbuljong (eller standardmedia som inte innehåller en hög koncentration av socker).
2. Tillsätt 0,2 ml 1% α-naftol, tillsätt sedan 0,3 ml 1% p-aminodimetylanilinoxalat (Gaby och Hadley reagens).
3. skaka kraftigt för att säkerställa blandning och grundlig syresättning av kulturen.,
4. Observera för färgändringar.
5. mikroorganismer är oxidaspositiva när färgen ändras till blå inom 15 till 30 sekunder. Mikroorganismer fördröjs oxidas positivt när färgen ändras till lila inom 2 till 3 minuter. Mikroorganismer är oxidas negativa om färgen inte ändras.

resultat tolkning av Oxidastest

positivt resultat

utveckling av en djup lila-blå / blå färg indikerar oxidasproduktion inom 5-10 sekunder.

negativt resultat

ingen lila-blå färg / ingen färgförändring.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., h2>

positiv kontroll: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

negativ kontroll: Escherichia coli ATCC 25922

begränsningar av Oxidastest

1. reagenserna som används i oxidastestet har visat sig Auto-oxidera, så det är mycket viktigt att använda färska reagenser, inte äldre än 1 vecka.
2. både bakterier och jäst som odlas på media som innehåller höga koncentrationer av glukos visar inhiberad oxidasaktivitet, så det rekommenderas att testa kolonier som odlas på media utan överskott av socker, såsom näringsagar., Tryptic soy agar är också ett utmärkt media.
3. bakterier som odlas på medier som innehåller färgämnen kan ge avvikande resultat.
4. testreagenserna kommer effektivt att döda mikroorganismerna, så subkulturering bör göras innan reagens tillsätts till en aktiv kultur.
5. oxidastestet kan användas vid presumtiv identifiering av Neisseria och vid differentiering och identifiering av gramnegativa baciller. Oxidaspositiva organismer bör undersökas av gram stain för att bestämma morfologi och gramreaktion., Ytterligare biokemiska tester rekommenderas för fullständig identifiering.
6. användning av en nichrom eller annan järninnehållande slinga kan ge falska positiva reaktioner. Platina slingor rekommenderas.
7. de flesta Haemophilus är oxidaspositiva. Mindre känsliga remsor eller reagenser kan ge falskt negativa resultat.
8. Oxidasreaktioner av gramnegativa baciller bör bestämmas på icke-selektiva och icke-differentiella medier för att säkerställa giltiga resultat. Kolonier som tas från media som innehåller höga glukosnivåer kan också ge falska negativa reaktioner.,
9. Det rekommenderas att använda kolonier som är 18-24 timmar gamla. Äldre kolonier kommer att ge svagare reaktioner.
10. eventuella färgförändringar som visas efter 20 sekunder bör ignoreras.