nästa generations sekvenseringsmetoder (ngs) började dyka upp i litteraturen i mitten av 2000-talet och hade en transformativ effekt på vår förståelse av mikrobiella genomik och infektionssjukdomar. Det finns dock betydande kontroverser om hur, när och var nästa generations sekvensering kommer att spela en roll i det kliniska diagnostiska laboratoriet., En djupdykning led-kontrapunkt diskussionen från Journal of Clinical Microbiology diskuterar de utmaningar och möjligheter som kan komma med införandet av metagenomic nästa generations sekvensering (mNGS) i rutin laboratorier. Vad exakt är MNG och hur skiljer det sig från de många andra nukleinsyrateknikerna där ute?

Vad är metagenomic nästa generations sekvensering?

nästa generations sekvensering är någon av flera hög genomströmning sekvenseringsmetoder där miljarder nukleinsyrafragment kan samtidigt och oberoende sekvenseras., Kontrast denna teknik till klassiska metoder såsom Sanger sekvensering (även känd som dideoxinukleotid kedja terminering sekvensering), som bearbetar en nukleotid sekvens per reaktion.
för att karakterisera ett bakteriellt genom med hjälp av NGS, till exempel, är genomet delas upp i flera fragment som producerar sekvenser eller läser allt från hundratals till tiotusentals baser i längd. Sekvenserna monteras i ett enda genom med hjälp av beräkningsmetoder. Flera överlappande sekvens läser bitas ihop för att producera en enda längre sekvens som kallas en contig., Det finns ofta luckor mellan contigs och även om high-fidelity längre sekvens läser skulle vara den perfekta metoden för sekvensering, plattformar som producerar kortare läser är i allmänhet mindre kostsamma och överlappningen i sekvenser gör dem mer exakta. Det konstruerade genomet (som sannolikt innehåller luckor) är anpassat till en referensdatabas för identifiering av organismen. Denna teknik representerar ett betydande framsteg under de tidiga dagarna av sekvensering när ett enda bakteriellt genomprojekt kan ta flera år.,
Metagenomic NGS (mNGS) kör helt enkelt alla nukleinsyror i ett prov, som kan innehålla blandade populationer av mikroorganismer och tilldela dessa till deras referensgenom för att förstå vilka mikrober som är närvarande och i vilka proportioner. Förmågan att sekvensera och identifiera nukleinsyror från flera olika taxa för metagenomisk analys gör detta till en kraftfull ny plattform som samtidigt kan identifiera genetiskt material från helt olika riken av organismer.,
de möjliga kliniska tillämpningarna är enorma, inklusive diagnos av infektionssjukdomar, utbrottsspårning, övervakning av infektionskontroll och mutation och patogen upptäckt, bland många andra. Mng, ibland kallad shotgun-sekvensering, av kliniska prover har applicerats på olika Provtyper, inklusive cerebrospinalvätska, blod, andningsprover, gastrointestinal vätska och okulär vätska.

vilka är fördelarna med metagenomic Next Generation Sequencing?,

den största styrkan hos Mng är att det är en opartisk hypotesfri diagnostisk metod, till skillnad från riktade polymeraskedjereaktion (PCR) metoder som är beroende av primers för identifiering av specifika mål som ska förstärkas och detekteras. Även universella eller breda PCR-metoder är inte tillräckligt breda för att betraktas som metagenomiska, eftersom de använder specifika primrar av konserverade 16S ribosomal RNA (rRNA) gen och interna transkriberade spacer (ITS) sekvenser för att förstärka distinkta nukleinsyrasekvenser som kan bioinformatiskt klassificeras i bakterier/archaea respektive svampar.,
universella primers utgör också ett problem vid diagnos av polymikrobiella infektioner med molekylära test. Om polymikrobiella populationer är närvarande vid användning av 16S-sekvensering, kommer flera bassamtal att göras per nukleotid, vilket ger ett blandat nukleotidkromatogram som inte kan tolkas. Även om det finns de-convolutional computational metoder tillgängliga för att förutsäga organismer identifierade, dessa är inte i standardanvändning för många laboratorier, som ofta reflex till nästa generations sekvensering av 16S-genen för polymikrobiella prover.,

vilka är utmaningarna med metagenomic Next Generation Sequencing?

trots Mng: s potential finns det många hinder att rensa innan tekniken kan bli en del av det vanliga laboratoriet, liksom luckor i vår förståelse för dess diagnostiska verktyg. Stora reservationer inkluderar tolkningen av fynd (skilja förorening och kolonisering från sanna patogener), urval och validering av databaser som används för analyser och förutsägelse (eller brist på sådan) av antimikrobiell känslighet., En vanlig uppfattning är att Mng är så otroligt känslig att det kommer att avslöja en diagnos när alla andra tester är negativa. Medan Mng kan vara analytiskt känsligare än standardkulturmetoder i vissa fall kan det nödvändiga avlägsnandet av stora mängder Human nukleinsyra under sekvenseringspreparat och (med beräkningsmetoder) under post-analytisk process minska känsligheten i jämförelse med riktade PCR-tillvägagångssätt för många organismer.

specificiteten av mNGS förblir den ökända elefanten i rummet., Kontaminering av prover under provtagning är ett stort problem med tanke på den ökade analytiska känsligheten hos Mng jämfört med standardodlingsmetoder, och det måste finnas en validerad kvalitetskontrollprocess för steg från att bedöma reagensets renhet till att mäta lämpliga genomtäckningskontroller. Dessutom, med vissa Illumina plattformar, fel streckkod index kan betecknas, vilket leder till falska positiva på sekvenseringsdata., Bioinformatiska kvalitetskontroller behövs för att säkerställa att högkvalitativa och validerade genom finns tillgängliga med minimala databasfel och det skulle helst finnas bioinformatisk personal tillgänglig för att tolka sekvenseringsresultat för varje test, vilket inte är tillgängligt vid de flesta kliniska mikrobiologiska laboratorier., Federal Drug Administration (FDA) har samarbetat med andra federala myndigheter för att curate en databas med titeln FDA-ARGOS (FDA-databas för regulatory-grade microbial sequences), som har varit användbar för att säkerställa att nuvarande Mng resultat är tillförlitliga och korrekta, men dessa resurser måste uppdateras och underhållas.
den större frågan kvarstår kring den kliniska specificiteten hos Mng: är de detekterade sekvenserna från patogener som bidrar till patientens nuvarande sjukdom?, Den analytiska specificiteten hos mNGS-testningen kan hanteras med noggranna kontroller i hela provsamlingen, sekvenseringsbibliotekets förberedelse, analyskörning och bioinformatisk klassificering, men klinisk specificitet behandlas inte direkt av dessa tillvägagångssätt. Frågor som kan hjälpa till att bestämma klinisk nytta och tillämplighet inkluderar: Hur kan vi skilja organismer relaterade till övergående bakteriemi från oral/gastrointestinal flora eller hudkolonisatorer i blod/plasma Mng-testning?, Hur ska sekvenseringsdjupet rapporteras och hur tillförlitligt är förhållandet mellan sekvensdjupet och sann infektion? Skiljer sig detta förhållande mellan patogen / värd? Hur länge är den förväntade detekterbara halveringstiden för en patogen av Mng när patienten får lämplig kurativ behandling? Studier om klinisk nytta och kostnadseffektivitet är mycket nödvändiga trots den obestridliga kraften i denna teknik från ett forsknings-och upptäcktsperspektiv.,
det är också värt att påpeka att det inte finns några FDA-godkända eller godkända mNGS-test som kan skickas för mikrobiell testning, även om det finns laboratorier som är certifierade enligt de kliniska Laboratorieförbättringsändringarna från 1988 (CLIA ’88) som erbjuder testning på kliniska prover. Hittills har endast ett fåtal diagnostiska NGS-system rensats av FDA för onkologisk testning eller upptäckt av cystisk fibros, till exempel., En ny översyn beskriver i detalj många av de regleringshinder och överväganden som måste åtgärdas innan Mng kan komma in i vanliga kliniska diagnostiska laboratorier som ett FDA-validerat test.
Sammanfattningsvis, medan mngs-testning sannolikt kan spela en viktig roll i det mikrobiologiska diagnostiska arbetsflödet i framtiden, särskilt som sekvensering och bioinformatisk processorkraft utvecklas, är detta fortfarande en högkomplexitetsteknik för vilken det kliniska nyttan i vår nuvarande medicinska praxis är osäker., Även om mngs-testning kan erbjuda nya och spännande diagnostiska kliniska möjligheter inom en snar framtid, kommer ingen av det sannolikt att ersätta en skarpsinnig kliniker när som helst snart.