Efter att ha studerat vid RADA från 1992 till 1995, Macfadyen blev känd i British theatre i första hand för sitt arbete med the stage company Kinden av Käke, som han spelade Antonio i Hertiginnan av Malfi, Charles Ytan i Skolan för Skandalen, och Benedick i Mycket Väsen för Ingenting. Hans Benedick spelades som en officer-klass buffoon med mustasch och ett braying skratt. År 2005 spelade han prins Hal i Henrik IV, delar ett och två på Kungliga Nationalteatern, med Michael Gambon i rollen som Falstaff., År 2007 återvände han till scenen och porträtterade en amerikansk, Clay, en hemmafader med en liberal attityd i leken the Pain and The Itch.

ett TV-genombrott kom när han uppträdde som Hareton Earnshaw i en anpassning av Wuthering Heights, som screenades på ITV-nätverket 1998. Ytterligare tv-drama arbete följde, inklusive huvudroller i dramas Warriors (1999) och The Way We Live Now (2001), båda för BBC. Även 2001 fick han beröm för sin huvudroll i BBC Two drama serial Perfect Strangers, som skrevs och regisserades av Stephen Poliakoff., I 2002, han medverkade i Projektet, en BBC-drama kartläggning av New Labour makten. Han spelade in i Spooks, som blev en framgång när han screenades på BBC One. En längre andra säsong visades 2003, och en tredje säsong sändes hösten 2004, med honom lämnar serien i det andra avsnittet. Serien sändes som MI-5 på nätverket a&E. År 2007 uppträdde han i One-off Channel 4 drama Secret Life, som behandlade det kontroversiella ämnet pedofili., Macfadyen vann pris som Bästa Skådespelare vid Royal Television Society Awards 2007 för denna del, och var nominerad till en BAFTA. Han medverkade också i en kort skiss för Comic Relief som brudgummen i Mr. Bean bröllop, tillsammans med Rowan Atkinson och Michelle Ryan.

Macfadyen dök upp i filmer inklusive Enigma (släpptes 2001), och i min fars Den, för vilken han fick Nya Zeeland Screen Award för Bästa Skådespelare., Han medverkade som den romantiska bly Fitzwilliam Darcy i en anpassning av Pride and Prejudice, släpptes i Storbritannien i September 2005.

Macfadyen medverkade i Frank Oz Död på en Begravning och Upphetsande film, baserad på Chris Cleave roman tillsammans med Michelle Williams och Ewan McGregor. Han medverkade också i Ron Howards film Frost / Nixon, där han spelade John Birt. 2008 spelade han den manliga huvudrollen Arthur Clennam i BBC-anpassningen av Charles Dickens lilla Dorrit., Under 2009 medverkade Macfadyen tillsammans med den Oscarsnominerade skådespelerskan Helena Bonham Carter i BBC Four-filmen Enid, baserad på livet av Enid Blyton, som Hugh Pollock, Blytons förläggare och första make.

2010 spelade han Sheriffen i Nottingham i Robin Hood. Han spelade som Prior Philip i tv-serien The Pillars of the Earth, och var medelålders Logan Mountstuart i något mänskligt hjärta. I juni 2010 vann Macfadyen en British Academy Television Award för bästa stödjande skådespelare för sitt arbete i straffrätt.,under 2011 gjorde Macfadyen en sista cameo i BBC show Spooks, och 2012 spelade han Oblonsky i Joe Wrights film Anna Karenina. I December 2012 började han skildra Detective Inspector Edmund Reid i BBC: s Ripper Street.under åren 2013-2014 spelade han Jeeves i produktionen av Jeeves och Wooster i perfekt nonsens på Hertigen av Yorks teater i West End Of London. Pjäsen vann 2014 Olivier award för bästa nya komedi.

i 2015 Amazon Prime plockade upp Ripper Street och, efter bra recensioner, det återförenades för fjärde och femte säsonger., Macfadyen sa att han var ”glad över att inleda en annan dos av Ripper Street-blod och tarmar, fickur och viktorianska huvudbonader, underbart mörka, rörliga och mystiska berättelser från Richard Wardlow”. Serien sändes också i USA på BBC America. Även i 2015 spelade han gäst i pilotavsnittet av The Last Kingdom.

han stjärnor för närvarande som Tom Wambsgans i HBO-serien Succession, för vilken han fick en Primetime Emmy Award nominering.,

år 2020 uppträdde han i rollen som Major Charles Ingram i ett tredelat ITV-drama, Quiz, baserat på den kontroversiella hostande fuskskskandalen om vem som vill bli miljonär 2001.