Design av den syntetiska acetyl-CoA vägen

det enklaste sättet att syntetisera organiskt kol från en-kol är att konstruera den en efter en., För att bygga en artificiell acetyl-CoA-väg från ett kol föreslog vi den syntetiska Acetyl-CoA (SACA) vägen, där två molekyler formaldehyd skulle överföras till en molekyl acetyl-CoA genom endast tre steg (Fig. 1a). För det första skulle formaldehyd kondenseras till glykolaldehyd (GALD) genom glykolaldehydsyntas (GALS). Och sedan skulle glykolaldehyd omvandlas till acetyl-fosfat (AcP) av acetyl-fosfatsyntas (ACP) med användning av oorganiskt fosfat. Slutligen skulle AcP användas för att producera acetyl-CoA av det kända enzymet fosfat acetyltransferas (pta)25., Under tiden kan formaldehyd erhållas genom att minska koldioxid och formatera26 eller oxidera metan och metanol27. Således kunde vi inse biosyntesen av acetyl-CoA från formaldehyd och till och med andra en-kolresurser.

termodynamiken kan återspegla huruvida en väg effektivt kan utföras in vivo eller in vitro. Vi beräknade den termodynamiska kemiska drivkraften hos den konstruerade SACA-banan., Den totala reaktionen från formaldehyd till acetyl-CoA är mycket termodynamiskt gynnsam, där den totala Gibbs energiförändring (ΔrG ’ m) av hela reaktionen är ca -96,7 kJ mol−1 (Fig. 1b och Tilläggstabell 1). Värdet av MDF (maximal drivkraft) används vanligtvis för att utvärdera den termodynamiska och kinetiska kvaliteten på olika vägar28. Om MDF är tillräckligt hög innehåller vägen inga termodynamiska flaskhalsar som skulle hindra dess funktion in vivo. Saca-banan erhöll det relativt höga MDF-värdet på 26.,9 kJ mol-1, som uppenbarligen är högre än FLS och MCC vägar (deras MDF värden är 1,9 och 5,8 kJ mol−1, respektive). Därför är SACA-vägen termodynamiskt gynnsam för biosyntesen av acetyl-CoA från formaldehyd.

identifiering av ett nytt enzym från C1 till C2

kondens av formaldehyd kan katalyseras av n-heterocyklisk karbin i kemistry29, 30. I biologi har tiazoliumringen av kofaktortiamindifosfat (ThDP) liknande funktion, vilket kan aktivera en aldehyd och sedan bilda dimer med en annan aldehyde31., För att hitta ett enzym för att kondensera två molekyler formaldehyd i en molekyl av glykolaldehyd, hänvisade vi till de katalytiska mekanismerna hos thdp-beroende enzymer och konstruerade en teozymmodell, som inkluderar ThDP, glykolaldehyd och glutaminsyra som ger elektron för reaktionen32 (Fig. 2a). Alla enzymer i Protein Data Bank (PDB) screenades praktiskt taget baserat på teozymmodellen och 37 icke-överflödiga proteinstrukturer med ligand ThDP uppnåddes (kompletterande Fig. 1 och kompletterande anmärkning)., Enligt de katalytiska mekanismerna för thdp-beroende enzymer33, 34, 35, C2 atom i ThDP är det aktiva centrumet. Avståndet mellan C2 atom och produkten av glykolaldehyd är avgörande för att utlösa den katalytiska reaktionen (Fig. 2a). Således analyserade vi avståndet mellan C2 atom och glykolaldehyd i varje kandidatprotein.

baserat på de genomsnittliga avstånden i varje protein med hjälp av molekylär dockning (kompletterande Data 1)36 definierades sex kandidater med korta avstånd och tydliga funktionella anteckningar som kandidater (Fig. 2b och Tilläggstabell 2). Dessutom valdes tre proteiner med långa avstånd slumpmässigt som kontroller. Kandidaterna och kontrollerna uttrycktes och renades för att testa deras förmåga att producera glykolaldehyd från formaldehyd., Tre av sex kandidater uppvisade den önskade aktiviteten, medan tre kontroller inte hade funktionen, vilket indikerar avståndet mellan C2 atom och glykolaldehyd spelar en kritisk roll vid kondensering av formaldehyd. Bland tre aktiva kandidater rapporterades proteinet 2uz1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) som benämndes bensaldehydlyas (BAL), att preferentiellt generera dihydroxiaceton (DHA) trots det minimala utbytet av glykolaldehyd när koncentrationen av formaldehyd var lägre37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

riktad utveckling av glykolaldehydsyntas

eftersom BAL hade konstruerats för att producera DHA från formaldehyde22 föreslog vi att detektera om motsvarande mutationer i BFD också skulle bidra till att förbättra enzymaktiviteten (kompletterande Fig. 2). Genom att screening alla muterade rester, fann vi faktiskt en mycket aktiv mutation W86R-N87T som var belägen i substratkanalen av BFD (kompletterande Fig. 3). Således infördes denna mutation (W86R-N87T) i BFD och varianten märktes som M1., För att ytterligare förbättra BFD: s katalytiska aktivitet föreslog vi att alla rester skulle screenas runt BFD: s aktiva centrum, där 25 positioner inom 8 Å avstånd från det aktiva centrumet valdes för att göra enpunktsmättnadsmutagenes (kompletterande Fig. 4). Vi utvecklade en metod för screening med hög kapacitet för att detektera glykolaldehyd genom färgreaktion mellan glykolaldehyd och difenylamin, som mättes med spektrofotometriskt övervakning vid 650 nm (kompletterande Fig. 5)., Efter screening fann vi att 14 av 25 positioner visade högre aktiviteter än M1 mutant (kompletterande Fig. 6). Därefter, 14 positioner var indelade i 8 grupper: En (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378) och H (T379/T380). N27 användes tre gånger eftersom varianterna i denna position visade den högsta aktiviteten. Med M1 som mall introducerade vi varje grupp av mutationer i M1 och valde den högsta aktiva mutanten, som märktes som M2., Genom att utföra tre rundor av iterativ kombinatorisk mutagenes bland dessa positioner screenade vi helt 64.512 kloner och erhöll en högaktivitetsmutant som innehåller fem nya mutationer runt det aktiva centret. Slutligen namngavs varianten med 7 restmutationer som glykolaldehydsyntas (GALS). KCAT av GALS förbättrades ca 160-faldigt och den slutliga katalytiska effektiviteten hos GALS är 9,6 m-1 * s-1, vilket är ungefär 70-faldigt än utgångsenzymet (Fig. 3a och Kompletterande Fig. 7).

för att räkna ut hur dessa mutationer förbättrar enzymaktiviteten föreslog vi att göra om kristallisering av GALS. Den aktiva fickan lokaliserar vid gränssnittet för homodimer av GALS38., Proteinstrukturen hos GALS kan skilja sig från utgångsproteinet efter flera omgångar av mutation. Här kristalliserade vi GALS protein och hämtade GALS kristallstruktur med hjälp av strukturen av BFD som sökmodell (Tilläggstabell 3). Kristallstrukturen hos GALS analyserades (kompletterande Fig. 8 Kompletterande Fig. 9). Vi fann att mutationen av L110E introducerar två ytterligare vätebindningar till hydroxylgruppen av mellanliggande analog( ima), vilket kan bidra till att stabilisera övergångstillstånd och klyva C–C-bindning mellan produkt och cofactor ThDP (Fig. 3b)., Mutationen av L109G utvidgade volymen av substratbindningsficka genom att ersätta den stora isobutylgruppen med en vätegrupp. Den tredje mutationen av a460m kan omorientera substratet och sedan förbättra interaktionen mellan ThDP och substrat. De två sista mutationerna h281v och Q282F utvidgade porradien på utsidan och kan underlätta åtkomst för substrat eller produkt (Fig. 3C). Jämfört med M1 utvidgades volymen av reaktionsficka i GALS mer än 30%, vilket skulle vara den främsta orsaken till förbättringen av katalytisk aktivitet.,

identifiering av acetyl-fosfatsyntas

i naturen rapporterades inget enzym för att uppnå syntesen av AVS från glykolaldehyd. Fosfoketolaser (PKs) kan producera AVS från fruktos-6-fosfat (F6P)eller xylulos-5-fosfat (X5P) 39. Enligt den katalytiska mekanismen för PKs, är det möjligt att glykolaldehyd interagerar med ThDP och sedan genererar 2-α,β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), som är den viktigaste mellanprodukten för att bilda AVS från F6P eller X5P med PKs. För att bekräfta vår hypotes valde vi åtta kandidater (Fig., 4b) baserat på fylogenetiskt träd av PKs från 111 bakteriefamiljer (kompletterande Fig. 10). Efter gensyntes och proteinrening (kompletterande Fig. 11) undersökte vi den katalytiska aktiviteten hos alla kandidatproteiner med hjälp av glykolaldehyd som substrat. Lyckligtvis visade fem av åtta PKs betydande katalytiska aktiviteter. Endast PK1, PK4 och PK8 visade ingen signifikant skillnad från blank-kontrollen. Således kallades PK2 med den högsta aktiviteten som acetyl-fosfatsyntas (ACPS), vars kcat/Km uppnår 3,21 m−1·s−1 (kompletterande Fig. 12).,

för att avslöja mekanismen för att bilda dhethdp från glykolaldehyd föreslog vi att utföra teoretisk analys baserad på den tidigare beräkningsmodellen för PK40. Alla möjliga aminosyror relaterade till bildandet av DHEThDP användes för att konstruera beräkningsmodellen (kompletterande Fig. 13)., Baserat på beräkningssimulering fann vi att energibarriären endast är 11,36 kcal mol-1 för bildandet av IM1 (mellanliggande 1) när glykolaldehyd protonerades av His553, vilket ansågs vara den mest möjliga protondonor40 (Fig. 4c). Sedan, IM1 tautomerizes i IM2 med hjälp av Glu479 och Glu437. IM2 är energiskt stabilare än IM1. När proton av IM2 avlägsnades av N4′ i ThDP, energibarriären från IM2 till Nyckel mellanliggande DHEThDP är 15.,13 kcal mol−1, som är lika som spänningsenergin under bildandet av DHEThDP med användning av F6P som substrat40. Efter bildandet av DHEThDP är följande katalytiska processer desamma som andra PKs (kompletterande Fig. 14), dvs H97 fungerar som protondonator av dehydreringsprocessen av DHEThDP, och His142 och Gly155 påskynda dehydreringsprocessen av DHEThDP, att döma av det faktum att His142 och Gly155 bildar vätebindningar med vattenmolekylen i strukturen av den post-dehydrering mellanliggande (AcThDP)., His64, Tyr501 och Asn549 är viktiga för Pi: s nukleofila attack och de bildar tillsammans bindningsplatsen för Pi39. Platsstyrda mutagenesexperiment indikerade också att dessa rester är pivotala för enzymaktivitet (kompletterande Fig. 15).

syntes av acetyl-CoA från formaldehyd in vitro

med den inledande framgångsrika utformningen av GALS och ACPS, vi avsett att konstruera SACA vägen in vitro för att syntetisera acetyl-CoA från formaldehyd. För det första mätte vi utbytet av glykolaldehyd av GALS under olika koncentrationer av formaldehyd., Resultaten visade att GALS effektivt kan katalysera dimeriseringen av formaldehyd, och utbytet av glykolaldehyd ökade med koncentrationen av substratet förbättrades (Fig. 5a). Till exempel ökade utbytet av glykolaldehyd från formaldehyd från 45% vid 0,5 g L−1 till 80% vid 2 g L−1. För det andra undersökte vi katalysatorns effektivitet från glykolaldehyd till AVS, som kvantifierades av innehållet av ättiksyra eftersom AVS snabbt skulle brytas ned till ättiksyra (kompletterande Fig. 16)23., Resultaten visade att utbytet av AVS nådde mer än 80% under olika koncentrationer av glykolaldehyd via ACPS (kompletterande Fig. 17). Tyvärr hämmades ACPS uppenbarligen av formaldehyd (Fig. 5b). Således är det nödvändigt att ta en balans för koncentrationen av formaldehyd för att lösa denna konflikt.

för att optimera koncentrationen av formaldehyd utfördes ett gradientexperiment med hjälp av reaktionssystemet som innehåller 2 mg mL−1 av GALS och ACPS. Med ökande koncentration av formaldehyd ökade utbytet av ättiksyra i systemet initialt och minskade sedan (Fig. 5c). När koncentrationen av formaldehyd är 1 g L-1, nådde utbytet av ättiksyra till 50,6%., Intressant är det slutliga utbytet av ättiksyra ännu högre än i reaktionssystemet från glykolaldehyd till AVS med samma mängd formaldehyd (Fig. 5B, grå-line). Detta skulle orsakas av att delvis frigöra funktionen av ACPS eftersom formaldehyd gradvis konsumeras av GALS. Baserat på detta system tillsatte vi ytterligare ett annat känt enzym fosfat acetyltransferas (PTA), vilket skulle omvandla AcP till acetyl-CoA. Slutligen producerade SACA-banan 5,5 mM acetyl-CoA vid formaldehydkoncentrationen av 1 g L−1. Utbytet av acetyl-CoA från formaldehyd var ca 33% (Fig. 5d)., Utbytet av ättiksyra (7,8 mM) från formaldehyd (33,3 mM) nådde dock 50% om PTA och CoA inte levererades. Den lägre avkastningen av acetyl-CoA än den för ättiksyra skulle orsakas av instabiliteten hos acetyl-CoA och AVS. Våra resultat visade att det är framgångsrikt för biosyntesen av acetyl-CoA från formaldehyd av SACA – vägen in vitro.,

validering av SACA-vägen genom 13C-märkning

Efter att ha fastställt SACA-vägen med renade enzymer in vitro försökte vi vidare testa biosyntesen av acetyl-CoA och det är derivat från SACA-vägen in vivo genom 13C-metaboliska traceranalyser (Fig. 6a). För det första användes celllysater för att verifiera biosyntesen av acetyl-CoA genom tillsats av 13C-märkt formaldehyd och CoA. Vi upptäckte signifikant ökning av den dubbla 13C-märkta acetyl-CoA än andra kontroller (P-värde < 0.001, t-test) (Fig. 6B och kompletterande Fig. 18)., Dessutom försvann ökningen av dubbel 13C-märkt acetyl-CoA om vi utelämnade en av generna i SACA-vägen som ACPS och PTA (kompletterande Fig. 19). Dessutom skulle acetyl-CoA konvergeras med oxaloacetat för att komma in i trikarboxylsyran (TCA) cykeln. Vi upptäckte också signifikant mer Dubbel 13C-märkt fumarat (p-värde < 0.001, t-test) och malat (p-värde < 0.001, t-test) endast i stammen med SACA-banan och 13C-märkt formaldehydmatning (Fig. 6B och kompletterande Fig. 18)., Vi upptäckte emellertid inte signifikanta skillnader i högre ordermassisotopomerer. Det skulle orsakas av den låga mängden dubbla 13C-märkta isotopomerer i TCA-cykeln.

därefter föreslog vi att testa kolflödet i celler. På grund av formaldehydens toxicitet för celler introducerade vi metanoldehydrogenas från Bacillus stearotermophilus (BsMDH)41 för att upprätthålla en kontinuerligt låg koncentration av formaldehyd in vivo (Fig. 6a). De odlade cellerna skördades vid olika tidpunkter och användes för att detektera proteinogena aminosyror och intracellulära metaboliter (Fig. 6c)., Vi fann att den stam med SACA väg (BsMDH-SACA) innehöll mer dubbel 13C-märkt aspartat och glutamat, som härrör från TCA-cykeln. Dessutom upptäcktes 13C-märkt glukos och fosfoenolpyruvat, vilket kan generera från dubbel 13C-märkt oxaloacetat genom glukoneogenesvägen, mer i stammen BsMDH-SACA än de i kontrollstammen (BsMDH-28a). Således visade våra resultat att SACA-vägen är funktionell för att producera acetyl-CoA och acetyl-CoA-härledda metaboliter från formaldehyd.,

utvärdering av SACA-vägen genom celltillväxt

för att ytterligare utvärdera SACA-vägen in vivo föreslog vi att celltillväxten skulle testas stegvis genom att mata varje intermediär i vägen. Ursprungligen växte E. coli upp under det rika mediet och sedan tillsattes glykolaldehyd som kompletterande kolkälla. Genom tillsats av olika koncentrationer av glykolaldehyd (kompletterande Fig. 20) fann vi att den konstruerade stammen som innehåller SACA-banan med mer än 0.,4 g L−1 glykolaldehyd utbudet har anmärkningsvärt högre OD600 än de stammar utan glykolaldehyd eller SACA vägen (Fig. 7a och Kompletterande Fig. 21). Bidraget av glykolaldehyd till biomassa (cellulär torrvikt, CDW) var 0,681 ± 0,028 gCDWg−1 (n = 3) glykolaldehyd.

När vi testade celltillväxt med formaldehyd som extra kolkälla, hämmades tillväxten av stammen med Tom vektor helt av 80 mg L-1 av formaldehyd (Fig. 7b). Stammen innehållande saca-vägen hämmades initialt och växte sedan upp normalt under samma tillstånd, vilket kan orsakas av dess snabbare formaldehydförbrukning än stammen med Tom vektor (kompletterande Fig. 22)., Tyvärr hade stammen innehållande SACA-vägen inte mer biomassa med tillägg av formaldehyd än de utan formaldehyd. Dessa resultat visade att även om saca-vägen är effektivare för att avlägsna giftig formaldehyd, räcker det inte med att tillhandahålla biomassa.

till sist avsåg vi att utvärdera saca-vägen genom att mata metanol, som kontinuerligt skulle omvandlas till formaldehyd. Vi fann att stammen som innehåller både bsmdh och SACA-banan har högre OD600 än de kontrollerna utan metanolförsörjning eller SACA-vägen (Fig. 7c och Kompletterande Fig., 23). Efter 26 h inkubation fann vi att värdet av OD600 i stammen innehållande både BSMDH och SACA-banan ökade ca 0,2, vilket är signifikant högre än stammen utan SACA-banan (p-värde = 0,005, t-test). Genom att jämföra med stammen utan SACA-vägen fann vi att mängden biomassa som härrör från metanol var 0,03 ± 0,006 gCDW g−1 (n = 3) metanol i stammen som innehåller SACA-vägen.