de genetiska sambanden mellan DNA reparation vägar och mänskliga cancer anlag har underblåst intresse för proteiner som känner igen och reparera specifika platser av DNA-skada. Reparationsenzymerna är anmärkningsvärt bevarade från bakterier till svampar till människor, vilket understryker premien som läggs på att upprätthålla genomisk integritet inför en mutagen börda., DNA är mottagligt för skador orsakade av fel som begåtts under replikering och av miljöfaktorer, såsom strålning, oxidanter eller alkylerande medel. Reparations reaktioner innebär excision av kemiskt förändrade eller felparade baser från DNA duplex. Resulterande luckor fylls i av DNA-polymeraser; denna reaktion lämnar ett nick vid eller flankerar platsen för reparation. En analog process sker under kromosomal DNA-replikation, varvid 5 ’ – RNA-segmenten som primär diskontinuerlig syntes av Okazaki-fragment skärs ut och de mellanliggande luckorna fylls i av DNA-polymeras.,

DNA-reparations-och replikeringsvägarna konvergerar på ett gemensamt sista steg där kontinuiteten hos den reparerade DNA-strängen återställs av DNA-ligas, ett enzym som omvandlar nicks till fosfodiesterbindningar. Nicks är potentiellt skadliga DNA-skador som, om de inte korrigeras, kan ge upphov till dödliga dubbelsträngar. Följaktligen är den totala förlusten av DNA-ligasfunktionen dödlig.

DNA-Ligasreaktion

DNA-ligaser katalyserar sammanfogningen av en 5′-fosfatterminerad sträng till en 3′-hydroxylterminerad sträng., Ligering beror på magnesium och en kofaktor med hög energi, antingen ATP eller NAD+. Reaktionsmekanismen innefattar 3 sekventiella nukleotidylöverföringsreaktioner. I det första steget resulterar nukleofil attack på Alfa-fosfor av ATP (adenosintrifosfat) eller NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid) genom ligas i frisättning av pyrofosfat eller NMN (nikotinamid-mononukleotid) och bildning av en kovalent mellanliggande (ligas-adenylat) i vilken AMP är kopplad via en fosfoamid (P-N) bindning till epsilon-aminogruppen av en lysin., I det andra steget överförs AMP Till 5′-änden av 5 ’ -fosfat-terminerad DNA-sträng för att bilda DNA-adenylat-en inverterad pyrofosfatbrostruktur, AppN. I denna reaktion attackerar DNA-strängens 5 ’ – fosfatsyre fosforen av ligasadenylat; den aktiva lysin sidokedjan är den lämnar gruppen. I det tredje steget, ligas katalyserar attack av 3 ’ – OH av nick på DNA-adenylat att ansluta sig till 2 polynukleotider och befria AMP.

fylogenetisk fördelning

levande organismer omfattar tre områden: eubacteria, archaeabacteria och eukaryotes., Alla organismer kodar för 1 eller flera DNA-ligaser. Ligaserna är grupperade i 2 familjer, ATP-beroende ligaser och NAD+-beroende ligaser, enligt det nukleotidsubstrat som krävs för ligas-adenylatbildning. ATP-beroende DNA-ligaser finns i alla 3 domäner. NAD + – beroende DNA-ligaser (LigA) är allestädes närvarande i bakterier, där de är nödvändiga för tillväxt och presenterar attraktiva mål för anti-infective drug discovery. NAD+-beroende ligaser förekommer endast sporadiskt utanför livets bakteriedomän, t. ex.,, i halofil archaea och vissa DNA-virus, och förmodligen förvärvades i dessa taxa genom horisontell genöverföring.

eukaryota cellulära ATP-beroende ligaser

ATP-beroende DNA-ligaser finns hos alla eukaryota arter. Däggdjursceller innehåller fyra DNA-ligasisozymer. Aminosyra-sekvensjämförelser tyder på att en kärnkatalytisk domän som är gemensam för alla ATP-beroende ligaser är utsmyckad av ytterligare isozymspecifika domäner belägna vid proteins amino-eller karboxyltermini., Man tror att dessa flankeringssegment förmedlar bindningen av däggdjurs-DNA-ligaser till andra proteiner som är involverade i DNA-replikering, reparation och rekombination. De däggdjursisozymer kallas ligas I, ligas IIIa, ligas IIIb, och ligas IV. DNA ligas I är en 919-aminosyra polypeptid, uttryckt i alla vävnader, som katalyserar sammanfogningen av Okazaki fragment under DNA-replikation och spelar också en roll i DNA reparation., DNA-ligaser IIIa (922 aminosyror) och IIIb (862 aminosyror) är produkterna från en enda gen; de skiljer sig endast i aminosyrasekvens vid deras karboxyltermini som en följd av alternativ mRNA-Splitsning. Ligas IIIa uttrycks allestädes närvarande och är inblandad i DNA-reparation och är avgörande för mitokondriell funktion. Ligas IIIb-uttrycket är begränsat till testiklarna, speciellt till spermatocyter som genomgår meios. DNA ligase IV är en 911-aminosyrapolypeptid som spelar en roll vid reparation av dubbelsträngade DNA-raster via icke-homologa slutförband (NHEJ).,

jästceller innehåller 2 separat kodade DNA-ligaser, vilka är homologa till däggdjurs-DNA-ligaser i respektive IV. DNA-ligaset i (CDC9P) av den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är avgörande för celltillväxt. Genetiska experiment implicerar ligas I I tätning Okazaki fragment och i slutförandet av DNA excision reparation. Däremot är jäst DNA ligas IV Inte nödvändigt för celltillväxt. Radering av LIG4-genen framkallar emellertid fenotyper som indikerar att ligase IV katalyserar reparationen av dubbelsträngsbrott i den icke-homologa änden som förbinder vägen (NHEJ)., Spirande jäst har ingen uppenbar homolog av däggdjurs DNA-ligas III.

virala ATP-beroende DNA-ligaser

bakteriella DNA-virus, såsom E. coli-bakteriofager T4, T6, T7 och T3, kodar sina egna ATP-beroende DNA-ligaser. ATP-beroende DNA-ligaser kodas också av eukaryotiska DNA-virus som utför en del eller hela sin replikationscykel i cytoplasman. Dessa inkluderar vaccinia virus, Afrikansk svinpest-virus, och Chlorella virus PBCV1. Bakteriofagen och eukaryotiska virala DNA-ligaser är mindre än deras cellulära motsvarigheter., Vaccinia DNA-ligas, en 552-aminosyrapolypeptid, är påfallande likartad vid aminosyrasekvensnivån till däggdjurs DNA-ligas III. ligas III är faktiskt närmare relaterat till vaccinia ligas än till däggdjursligaser I och IV. ligaserna av T4 (487 aminosyror), T7 (359 aminosyror), T3 (346 aminosyror) och Chlorella-virus (298 aminosyror) är fortfarande mindre. Vi har visat att Chlorella-virusbigaset kan komplettera tillväxten av en jäststam där DNA-ligas i-genen har tagits bort., Detta resultat tyder på att proteinsegmenten som är unika för den mycket större DNA-ligasen i inte är nödvändiga för jästcellstillväxt.

Nick-Sensing av DNA-ligaser

Vi har undersökt interaktionen mellan eukaryotiska ligaser och DNA med hjälp av viruskodade enzymer som modeller. Vaccinia virus DNA ligas och Chlorella virus DNA ligas varje bildar en diskret komplex med en enda nicked DNA ligand i frånvaro av magnesium som kan lösas från fritt DNA genom native polyakrylamid gel elektrofores., De virala ligaserna bildar inte stabila komplex med följande ligander: (i) DNA innehållande en 1-nukleotid eller 2-nukleotid gap; (ii) den förseglade duplex DNA-produkten av ligeringsreaktionen; (iii) en enda nickad duplex innehållande en 5′-OH terminus vid nick istället för en 5′-fosfat; eller (iv) en enda nickad duplex innehållande en RNA-sträng på 5′ – fosfatsidan av nick (10 till 15). Således har virala ATP-beroende DNA-ligaser en inneboende nick-avkänningsfunktion.,

Nick erkännande av vaccinia DNA ligas och Chlorella virus DNA ligas beror också på beläggning av AMP bindande fickan på enzymet-dvs mutationer av ligasen aktiva platsen som avskaffar förmågan att bilda ligas-adenylat mellanliggande också eliminera nick erkännande. medan en mutation som bevarar ligas-adenylatbildning men inaktiverar nedströms steg av strängen sammanfogningsreaktionen har ingen effekt på bindning till nicked DNA., Sekvestrering av en extrahelisk nukleotid med DNA-bunden ligas påminner om ”base-flipping” – mekanismen för målplatsigenkänning och katalys som används av andra DNA-modifiering och reparationsenzymer.

även om 5′-fosfatdelen är väsentlig för bindningen av Klorellavirusligas till nicked DNA, krävs inte 3′-OH-delen för nick-erkännande. Klorellavirusligas binder till en nickad ligand innehållande 2′, 3’dideoxi och 5′ -fosfat termini men kan inte katalysera adenylering av 5 ’ – änden., Således är 3 ’ – OH viktigt för steg 2 kemi även om det inte i sig är kemiskt transformerad under DNA-adenylatbildning.

för att avgränsa ligas-DNA-gränssnittet, fotspårade vi ligasbindningsstället på DNA. Storleken på exonuclease III fotavtryck av ligase bunden till en enda nick i duplex DNA är 19 till 21 nukleotider. Fotavtrycket är asymmetrisk, som sträcker 8 9 nukleotider på 3′-OH sidan av nick och 11 till 12 nukleotider på 5′-fosfat sida.,

kristallstruktur av eukaryotisk DNA-ligas-Adenylat

Chlorella virus DNA ligas (ChVLig) är den minsta eukaryota ATP-beroende ligas känd. Som den” minimala ” DNA-ligasen presenterade den ett attraktivt mål för strukturbestämning. Vi kristalliserade ChVLig och bestämde dess struktur vid 2 Å upplösning. Enzymet består av en större N-terminal nukleotidyltransferas (ntas) domän och en mindre C-terminal ob-domän med en klyfta mellan dem. En AMP moiety var kovalent kopplad till NZ av Lys27 på den aktiva platsen., Således har vi strukturen av en äkta katalytisk mellanprodukt.

inom ntasdomänen är en adenylatbindande ficka som består av de sex peptidmotiv (I, Ia, III, IIIa, IV och V) som definierar kovalenta nukleotidyltransferas enzymet superfamily som inkluderar DNA-och RNA-ligaser och mRNA capping enzymer. Motif I (kxdgxr) innehåller lysin till vilken AMP blir kovalent länkad i det första steget av ligasreaktionen. Aminosyror i motiven Ia, III, IIIa, IV och V kontakt AMP och spela viktiga roller i ett eller flera steg i ligering vägen., Ob domänen består av en fem-stranded antiparallel beta fat plus en alfa helix.

Strukturell Grund för Nick Erkännande av en Minimal ”Pluripotenta” DNA ligase

Även om ChVLig saknar stora N – eller C-terminal kompletterande domäner finns i eukaryota cellens arvsmassa ligases, det kan upprätthålla mitotiska tillväxt, DNA-reparation och nonhomologous slut att gå med i spirande jäst när det är den enda källan till ligase i cellen. ChVLig kan även utföra de väsentliga funktionerna hos däggdjurslig3 i mitokondriell DNA-metabolism., Vi föreslog att ChVLig representerar en avskalad ”pluripotenta” ligase på grund av dess inneboende nick avkänning funktion, utifrån vilket var upplyst när vi löst 2.3 Å kristall struktur ChVLig-AMP bunden till en 3′-OH/5′-PO4 nick i duplex-DNA.

ChVLig omger DNA: t som en C-formad proteinklämma. Ntase-domänen binder till de brutna och intakta DNA-strängarna i det stora spåret som flankerar nick och även i det mindre spåret på 3′-OH-sidan av nick. OB domänen binder över mindre spåret på framsidan av duplex bakom nick., En ny ”spärr” – modul-bestående av en beta-hårnålsslinga som härrör från ob – domänen-upptar det stora spåret och fullbordar omkretsklämman via kontakter mellan spetsen av slingan och ytan på ntase-domänen. Spärren är kritisk för klämstängning och är en nyckeldeterminant för nick-avkänning.

jämförelse av kristallstrukturerna i den fria och nick-bundna ChVLig-AMP avslöjar en stor domän omarrangemang som åtföljer nick-erkännande., I den fria ChVLig-AMP reflekteras ob-domänen bort från ntase-domänen för att fullständigt exponera DNA-bindningsytan ovanför AMP-bindningsfickan. Peptidsegmentet som är avsett att bli spärren är oordnat i det fria ligaset och känsligt för proteolys. Men detta segment är skyddat mot proteolys när ChVLig binder till nickat DNA. DNA-bindning innebär en nästan 180-rotation av OB-domänen runt en svängbar, så att den konkava ytan på ob beta-fat passar in i DNA – mindre spåret., Denna övergång framkallar en 63 Å rörelse av OB-domänen och placerar spärren djupt i DNA-huvudspåret.

ett nätverk av interaktioner med 3′-OH och 5 ’ – PO4 termini på den aktiva platsen belyste DNA-adenyleringsmekanismen och AMP: S kritiska roller i nick-sensing och katalys. Tillsats av en divalent katjon utlöste nick tätning i crystallo, och därigenom fastställa att nick komplexet är en bona fide mellanliggande i DNA reparation vägen.,

strukturen hos NAD + – beroende DNA-ligas bundet till Nicked DNA-adenylat

NAD+-beroende DNA-ligaser (kallad LigA) är en distinkt och strukturellt homogen klad av enzymer som finns i alla bakterier. E. coli LigA (671-aa) är prototypen för denna familj. LigA har en modulär arkitektur byggd kring en central ligaskärna bestående av en ntase-domän och en OB-domän. Kärnan flankeras av en N-terminal ”Ia” – domän och tre C-terminalmoduler: en tetracystein zink-finger, en helix-hairpin-helix (HhH) domän och en BRCT-domän., Varje steg i ligationsbanan beror på en annan delmängd av LigA-domänerna, med endast ntase-domänen som krävs för alla steg. Domän Ia är unik för NAD + – beroende ligaser, är ansvarig för att binda NMN-delen av NAD + och krävs för reaktionen med NAD + för att bilda ligas-AMP-mellanliggande.

Vi fann att NAD+-beroende E. coli DNA ligase kan stödja tillväxten av Saccharomyces cerevisiae stammar bort ensamma för CDC9 eller dubbelt för CDC9 plus LIG4., Detta är den första demonstrationen att ett NAD+ – beroende enzym är biologiskt aktivt i en eukaryotisk organism. Senare studier (i samarbete med Maria Jasin) visade att E. coli LigA skulle räcka för ligase funktion i musen ES-celler som saknar väsentliga Lig3 enzym.

vår kristallstruktur av E. coli LigA bunden till den nickade DNA-adenylatmediären visade att LigA också omger DNA-helixen som en C-formad proteinklämma. Protein-DNA-gränssnittet medför omfattande DNA-kontakter av ntase -, ob-och HHH-domänerna över ett 19-bp-segment av duplex-DNA centrerat om nick., Ntase-domänen binder till de trasiga DNA-strängarna vid och flankerar nick, ob-domänen kontaktar den kontinuerliga mallsträngen som omger nick, och HHH-domänen binder båda strängarna över det mindre spåret i periferin av fotavtrycket. Zn-finger-modulen spelar en strukturell roll för att överbrygga Ob-och HHH-domänerna. Domän Ia gör inga kontakter till DNA-duplex, i enlighet med sina dispensability för katalys av strand stängning på en AppDNA substrat.,

LigA ntase-och OB-domänerna är placerade på samma sätt på DNA-omkretsen till ntase-och OB-domänerna hos ATP-beroende DNA-ligaser, och de” fotavtryck ” liknande segment av DNA-strängarna. Ännu topologi LigA klämma skiljer sig starkt från de klämmor som bildas av ChVLig och mänskliga DNA ligase 1 (HuLig1, bestäms av Tom Ellenberger och kollegor). Kyssningskontakterna som stänger LigA-klämman är sui generis, som involverar ntase-domänen och C-terminalen HHH-domänen., Baserat på tillgängliga strukturella data är det uppenbart att DNA-ligaser har utvecklats minst tre olika sätt att omsluta DNA.

jämförelser av E. coli LigA-AppDNA-komplexet med strukturer av andra bakteriella ligaser fångade som binär LigA * – NAD+ – komplexet (steg 1—substrat), binär LigA•-NMN-komplexet (efter steg 1-gruppen) och kovalent ligas-AMP-mellanprodukt (steg1-produkt efter att ha lämnat gruppdissociation) markerar massiva proteindomäner (i storleksordningen 50 till 90 Å) som uppträder i synch med substratbindande och katalys., DNA-bindning och klämbildning genom LigA medför en nästan 180-rotation av OB-domänen så att den konkava ytan på ob beta-fat passar in i det mindre spåret, som liknar vad som ses eller härleds för ChVLig och HuLig1. HHH-domänens fyrpunktsbindning vid periferin av LigA-DNA-fotavtrycket stabiliserar en DNA-böjning centrerad vid nick. Den LigA-DNA-interaktioner omedelbart kompletterande nick framkalla en lokal DNA distorsion, vilket resulterade i antagandet av en RNA-som En form helix, igen ekande resultaten för HuLig1-DNA cocrystal.,

Mekanism av lysin adenylylation av ATP-beroende och NAD+-beroende polynucleotide ligases

auto-adenylylation reaktion polynucleotide ligases utförs av en nucleotidyltransferase (NTase) – domän som är bevarad i ATP-beroende DNA-och RNA-ligases och NAD+-beroende DNA-ligases. Ntase-domänen innefattar att definiera peptidmotiv som bildar nukleotidbindningsfickan. Motif i (KxDG) innehåller lysinet som blir kovalent fäst vid AMP. Som Robert Lehman påpekade 1974 är det oklart hur lysin (med ett förutsagt pKa-värde på ~10.,5) förlorar sin proton vid fysiologiskt pH för att uppnå det oskyddade tillstånd som krävs för attack på α-fosforn av ATP eller NAD+. I princip kan ligas använda en allmän bas för att deprotonera lysinen. Alternativt kan pKa drivas ner av positiv laddningspotential hos proteinaminosyror som omger lysin-Nz. Flera kristallstrukturer av ligaser frånvarande metaller gav knappa stöd för någon förklaring. I dessa strukturer ligger motivet i lysinnukleofil bredvid ett motiv IV glutamat eller aspartat sidokedja., Lysinet och motivet IV karboxylat bildar ett jonpar, vars förväntade effekt är att öka lysinens pKa på grund av omgivande negativ laddning. Det är osannolikt att en glutamat eller aspartat anjon kan fungera som allmän bas för att abstrahera en proton från lysinkatationen. En potentiell lösning på problemet skulle vara om en divalent katjon stannar lysin-Nz och driver ner sin pKa.,

En metall-driven mekanism avslöjades av våra senaste kristallstrukturen av Naegleria gruberi RNA ligase (NgrRnl) som steg 1 Michaelis komplex med ATP och mangan (dess föredragna metall infektioner). Nyckeln till att fånga Michaelis-liknande komplex var att ersätta lysinnukleofilen med en isosterisk metionin. 1,9 Å-strukturen innehöll ATP och två manganjoner i det aktiva stället. Den ”katalytiska” metallen samordnades med oktaedrisk geometri till fem vatten, som i sin tur samordnades av karboxylatsidkedjorna av konserverade rester i motiven i, III och IV., Den sjätte ligandplatsen i det katalytiska metallkomplexet upptogs av ett ATP-α-fosfatsyre, vilket indikerar en roll för metallen för att stabilisera övergångstillståndet för auto-adenylyleringsreaktionen. En viktig insikt, befäst genom överlagring av Michaelis-komplexet på strukturen hos kovalent NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP-mellanliggande, gällde rollen för det katalytiska metallkomplexet för att stabilisera det icke-protonerade tillståndet hos lysinnukleofilen före katalys, via lokal positiv laddning och atomkontakt av Lys-Nz till ett av metallbundet vatten., NgrRnl Michaelis-komplexet avslöjade en andra metall, samordnad oktahedrally till fyra vatten och till ATP β Och γ fosfatoxygener. Metallkomplexet och ATP γ-fosfatet var engagerade av ett ensemble av aminosyra sidokedjor (unika för NgrRnl) som kollektivt orienterar PPi-gruppen som lämnar apikal till lysinnukleofilen. I överensstämmelse med en enkelstegsmekanism inverterades α-fosfat stereokemiskt under övergången från NgrRnl•ATP Michaelis complex till lysyl–AMP intermediär.,

– DNA ligases tros ha utvecklats separat från RNA ligases, inledningsvis genom fusion av ett nedärvt ATP-använder NTase domän till en C-terminal OB domän (till att omfatta minimal katalytisk kärnan i en DNA-ligase), och därefter via fusion av ytterligare strukturella moduler till NTase-OB core (7). NAD+-beroende DNA-ligases (LigA enzymer), som är allestädes närvarande i bakterier och viktigt för bakteriella livskraft, som har förvärvat sin specificitet för NAD+ via fusion av en NMN-bindande Ia domän modul till N-terminalen av NTase domän., Escherichia coli DNA ligas (EcoLigA) var det första cellulära DNA-ligaset som upptäcktes och karakteriserades och det är fortfarande den främsta modellen för strukturella och funktionella studier av NAD+ – beroende DNA-ligasfamiljen. Intresset för LigA-mekanismen drivs av löftet att rikta LigA (via sin signatur NAD+ substratspecificitet och unika strukturella egenskaper gentemot mänskliga DNA-ligaser) för antibakteriell drogupptäckt.

Vi löste en 1,55 Å kristallstruktur av EcoLigA som Michaelis komplex med NAD+ och magnesium., Strukturen avslöjar en enmetallmekanism där ett ligasbundet Mg2+(H2O)5-komplex sänker lysin pKa och engagerar NAD+ α-fosfatet, men β-fosfatet och nikotinamidnukleosiden i NMN-gruppen är orienterade enbart via atominteraktioner med proteinelement som är unika för LigA clade. Den två-metall (för ATP-beroende ligas) kontra en-metall (för NAD+ – beroende ligas) dikotomi avgränsar en grenpunkt i ligasutveckling.