testul oxidazei detectează prezența unui sistem citocrom oxidază care va cataliza transportul electronilor între donatorii de electroni din bacterii și un colorant redox – tetrametil-p-fenilen-diamină. Colorantul este redus la culoarea violet profund., Acest test este utilizat pentru a ajuta la identificarea Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella și Pasteurella, toate producând enzima citocrom oxidază.un număr de reactivi pot fi utilizați pentru acest test.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismele care conțin citocrom c ca parte a lanțului lor respirator sunt oxidază-pozitive și transforma reactivul albastru / violet. Organismele care nu au citocrom c ca parte a lanțului lor respirator nu oxidează reactivul, lăsându-l incolor în limitele testului și sunt oxidază-negative.bacteriile pozitive oxidază posedă citocrom oxidază sau indofenol oxidază (un fier care conține hemoproteină). Ambele catalizează transportul electronilor de la compușii donatori (NADH) la acceptorii de electroni (de obicei oxigen)., Reactivul de testare, N, N, N’, N’-tetrametil-P-fenilendiamină, acționează ca un acceptor artificial de electroni pentru enzima oxidază. Reactivul oxidat formează compusul colorat indofenol albastru.sistemul citocromului este de obicei prezent numai în organismele aerobe care sunt capabile să utilizeze oxigenul ca receptor final de hidrogen. Produsul final al acestui metabolism este fie apă, fie peroxid de hidrogen (descompus de catalază).

scopul / utilizările testului de oxidază

• testul de oxidază este utilizat pentru a determina dacă un organism posedă enzima citocrom oxidază.,
• testul este utilizat ca un ajutor pentru diferențierea speciilor Neisseria, Moraxella, Campylobacter și Pasteurella (oxidază pozitivă).
• este, de asemenea, utilizat pentru a diferenția pseudomonadele de speciile înrudite.

procedura testului oxidazei

există multe variații ale metodei la testul oxidazei. Acestea includ, dar nu se limitează la, testul hârtiei de filtru, metoda plăcii directe, metoda tamponului, metoda benzii de testare oxidază impregnată și metoda tubului de testare. Toate timpurile și concentrațiile se bazează pe recomandările originale.,

Hârtie de Filtru Uscată Metodă

Deoarece oxidaza reactiv este instabilă și trebuie să fie proaspăt pregătite pentru a fi utilizate, această metodă este convenabil.

1. banda de hârtie de filtru Whatman No.1 este înmuiată într-o soluție proaspăt preparată 1% de diclorhidrat de tertrametil-p-fenilen-diamină.
2. după scurgere timp de aproximativ 30 de secunde, benzile sunt uscate prin congelare și depozitate într-o sticlă întunecată etanșată cu un capac cu șurub.
3. pentru utilizare, o bandă este îndepărtată, așezată într-un vas petri și umezită cu apă distilată.,
4. colonia care urmează să fie testată este preluată cu o buclă de platină și pătată peste zona umedă.
5. o reacție pozitivă este indicată printr-o nuanță intensă de purpuriu intens, care apare în 5-10 secunde, o reacție „pozitivă întârziată” prin colorare în 10-60 secunde și o reacție negativă prin absența colorării sau prin colorare mai târziu de 60 de secunde.

metoda hârtiei de filtru umed

1. o bandă de hârtie de filtru este înmuiată cu o soluție puțin proaspătă de 1% din reactiv.
2. o specie de cultură este frecată pe ea cu o buclă de platină.,
3. o reacție pozitivă este indicată printr-o nuanță intensă de purpuriu intens, care apare în 5-10 secunde, o reacție „pozitivă întârziată” prin colorare în 10-60 secunde și o reacție negativă prin absența colorării sau prin colorare mai târziu de 60 de secunde.

metoda plăcii directe

1. adăugați 2 -3 picături de reactiv direct la coloniile suspecte pe o placă de agar. Nu inundați placa cu reactivul.
2. observați schimbarea culorii în decurs de 10 secunde.notă: metoda plăcii directe trebuie efectuată pe o placă de agar neselectivă.,
   1. când se utilizează reactivul de oxidază Kovac, microorganismele sunt oxidază pozitive atunci când culoarea se schimbă în purpuriu închis în 5 până la 10 secunde. Microorganismele sunt întârziate cu oxidază pozitivă atunci când culoarea se schimbă în violet în 60 până la 90 de secunde. Microorganismele sunt oxidază negativă dacă culoarea nu se schimbă sau durează mai mult de 2 minute.
   2. când se utilizează reactivul Gordon și McLeod, microorganismele sunt oxidază pozitive atunci când culoarea se schimbă în roșu în 10 până la 30 de minute sau în negru în 60 de minute. Microorganismele sunt oxidază negativă dacă culoarea nu se schimbă.,

   metoda tamponului

   

   1. înmuiați tamponul în reactiv și apoi atingeți o colonie suspectă izolată
   2. observați schimbarea culorii în 10 secunde.

   metoda tubului de testare

   1. creșteți o cultură proaspătă (18 până la 24 de ore) de bacterii în 4, 5 ml de bulion nutritiv (sau medii standard care nu conțin o concentrație ridicată de zahăr).
   2. se adaugă 0,2 ml de α-naftol 1%, apoi se adaugă 0,3 ml de oxalat de p-aminodimetilanilină 1% (reactivi Gaby și Hadley).
   3. agitați puternic pentru a asigura amestecarea și oxigenarea completă a culturii.,
   4. observați schimbările de culoare.
   5. microorganismele sunt oxidază pozitive atunci când culoarea se schimbă în albastru în decurs de 15 până la 30 de secunde. Microorganismele sunt întârziate cu oxidază pozitivă atunci când culoarea se schimbă în violet în 2 până la 3 minute. Microorganismele sunt oxidază negativă dacă culoarea nu se schimbă.

   rezultat interpretarea testului oxidazei

   rezultat pozitiv

   dezvoltarea unei culori albastru-violet / albastru indică producerea de oxidază în 5-10 secunde.

   rezultat negativ

   nici o culoare Violet-Albastru / nici o schimbare de culoare.,

   Examples

   Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

   Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

   de Control al Calității pentru Testul Oxidazei

   Control Pozitiv: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

   Negativi: Escherichia coli ATCC 25922

   Limitări de Monoaminooxidază Test

   1. reactivilor utilizați în testul oxidazei-au dovedit a auto-oxida, deci este foarte important să se folosească proaspete reactivi, nu mai vechi de 1 săptămână.
   2. atât bacteriile, cât și drojdia cultivată pe medii care conțin concentrații mari de glucoză prezintă activitate oxidază inhibată, de aceea se recomandă testarea coloniilor cultivate pe medii fără exces de zahăr, cum ar fi agarul nutritiv., Agarul de soia triptic este, de asemenea, un mediu excelent.
   3. bacteriile cultivate pe medii care conțin coloranți pot da rezultate aberante.
   4. reactivii de testare vor ucide efectiv microorganismele, astfel încât subculturarea trebuie făcută înainte de adăugarea oricărui reactiv la o cultură activă.
   5. testul oxidazei poate fi utilizat în identificarea prezumtivă a Neisseriei și în diferențierea și identificarea bacililor gram-negativi. Organismele pozitive de oxidază trebuie examinate prin pete gram pentru a determina morfologia și reacția gram., Teste biochimice suplimentare sunt recomandate pentru identificarea completă.
   6. utilizarea unui nicrom sau a unei alte buclă care conține fier poate produce reacții fals pozitive. Buclele de platină sunt recomandate.
   7. majoritatea Hemofililor sunt pozitivi la oxidază. Benzile sau reactivii mai puțin sensibili pot da rezultate fals negative.
   8. reacțiile de oxidază ale bacililor gram-negativi trebuie determinate pe medii neselective și non-diferențiale pentru a asigura rezultate valide. De asemenea, coloniile prelevate din medii care conțin niveluri ridicate de glucoză pot da reacții fals negative.,
   9. se recomandă utilizarea coloniilor care au vârsta de 18-24 de ore. Coloniile mai vechi vor produce reacții mai slabe.
   10. orice modificări de culoare care apar după 20 de secunde nu trebuie luate în considerare.