conexiunile genetice dintre căile de reparare a ADN-ului și predispoziția la cancerul uman au alimentat interesul pentru proteinele care recunosc și repară anumite site-uri de deteriorare a ADN-ului. Enzimele de reparare sunt conservate remarcabil de la bacterii la ciuperci la om, subliniind prima pusă pe menținerea integrității genomice în fața unei sarcini mutagene., ADN – ul este susceptibil la daune cauzate de erori comise în timpul replicării și de factori de mediu, cum ar fi radiațiile, oxidanții sau agenții de alchilare. Reacțiile de reparare implică excizia bazelor modificate chimic sau greșite din duplexul ADN. Golurile rezultate sunt completate de ADN polimeraze; această reacție lasă o zgârietură la sau flancând locul de reparare. Un proces Analog are loc în timpul replicării ADN-ului cromozomial, prin care segmentele 5′ – ARN care sintetizează discontinuu fragmentele Okazaki sunt excizate, iar golurile care intervin sunt umplute de ADN polimerază.,căile de reparare și replicare a ADN-ului converg într-o etapă finală comună în care continuitatea catenei ADN reparate este restabilită de ligaza ADN, o enzimă care transformă nicks în legături fosfodiesterice. Nick-urile sunt leziuni potențial dăunătoare ale ADN-ului care, dacă nu sunt corectate, pot da naștere unor pauze letale cu două fire. În consecință, pierderea totală a funcției ligazei ADN este letală.

reacția ligazei ADN

LIGAZELE ADN catalizează îmbinarea unei catene terminate cu 5 ‘- fosfat la o catenă terminată cu 3 ‘ -hidroxil., Ligarea depinde de magneziu și de un cofactor de mare energie, fie ATP, fie NAD+. Mecanismul de reacție implică 3 reacții secvențiale de transfer nucleotidil. În prima etapă, atac nucleofil asupra alfa-fosfor de ATP (adenozin trifosfat) sau NAD+ (nicotinamid-adenin-dinucleotid) de ligase duce la eliberarea de pirofosfat sau NMN (nicotinamida mononucleotide) și formarea unui intermediar covalent (ligase-adenilat) în care AMPLIFICATORUL este legat printr-un phosphoamide (P-N) obligatiuni la epsilon-amino grup de lizină., În al doilea pas, AMP este transferat la 5′-la capătul 5′-fosfat-a reziliat ADN pentru a forma ADN-adenilat — o inversat pirofosfat de structură de pod, AppN. În această reacție, oxigenul 5’-fosfat al catenei ADN atacă fosforul ligazei-adenilat; lanțul lateral al lizinei situsului activ este grupul de plecare. În a treia etapă, ligaza catalizează atacul de 3 ‘ – OH al nick-ului pe ADN-adenilat pentru a se alătura polinucleotidelor 2 și a elibera AMP.organismele vii cuprind 3 domenii: eubacterii, arheabacterii și eucariote., Toate organismele codifică 1 sau mai multe ligaze ADN. Ligazele sunt grupate în 2 familii, ligaze dependente de ATP și ligaze dependente de NAD+, în funcție de substratul nucleotidic necesar pentru formarea ligazei-adenilat. LIGAZELE ADN dependente de ATP se găsesc în toate cele 3 domenii. Ligazele ADN dependente de NAD+(LigA) sunt omniprezente în bacterii, unde sunt esențiale pentru creștere și prezintă ținte atractive pentru descoperirea medicamentelor antiinfecțioase. Ligazele dependente de NAD+sunt întâlnite doar sporadic în afara domeniului bacterian al vieții, de exemplu.,, în arhaea halofilă și anumite virusuri ADN, și au fost probabil dobândite în aceste taxoni prin transfer de gene orizontal.

Ligazele celulare dependente de ATP eucariote

LIGAZELE ADN dependente de ATP se găsesc la toate speciile eucariote. Celulele de mamifere conțin patru izoenzime de ligază ADN. Comparațiile de secvențe de aminoacizi sugerează că un domeniu catalitic de bază comun tuturor ligazelor dependente de ATP este înfrumusețat de domenii specifice izozimelor suplimentare situate la terminalele amino sau carboxil ale proteinelor., Se crede că aceste segmente de flancare mediază legarea LIGAZELOR ADN de mamifere de alte proteine implicate în replicarea, repararea și recombinarea ADN-ului. Izoenzimele mamiferelor sunt denumite ligaza I, ligaza IIIa, ligaza IIIb și ligaza IV. ADN ligaza i este o polipeptidă de 919 aminoacizi, exprimată în toate țesuturile, care catalizează îmbinarea fragmentelor Okazaki în timpul replicării ADN și joacă, de asemenea, un rol în repararea ADN-ului., LIGAZELE ADN IIIa (922 aminoacizi) și IIIb (862 aminoacizi) sunt produse ale unei singure gene; ele diferă în secvența de aminoacizi numai la carboxil termini ca o consecință a îmbinării alternative a ARNm. Ligaza IIIa este exprimată omniprezent și este implicată în repararea ADN-ului și este esențială pentru funcția mitocondrială. Expresia ligazei IIIb este limitată la testicul, în special la spermatocitele supuse meiozei. ADN ligaza IV este o polipeptidă 911-aminoacid care joacă un rol în repararea pauzelor de ADN dublu-strand prin îmbinarea finală non-omoloagă (NHEJ).,

celulele de drojdie conțin 2 ligaze ADN codificate separat, care sunt omoloage cu LIGAZELE ADN de mamifere I și, respectiv, IV. ADN ligaza i (Cdc9p) a drojdiei în devenire Saccharomyces cerevisiae este esențială pentru creșterea celulară. Experimentele genetice implică ligaza I în sigilarea fragmentelor Okazaki și în finalizarea reparației exciziei ADN. În schimb, ligaza ADN de drojdie IV nu este esențială pentru creșterea celulelor. Cu toate acestea, eliminarea LIG4 gene provoacă fenotipuri indicând faptul că ligase IV catalizează reparații de dublu-strand pauze în non-omoloage end aderarea cale (NHEJ)., Drojdiile înmugurite nu au un omolog aparent al ADN-ului de mamifere ligaza III.

LIGAZELE ADN dependente de ATP virale

virusurile ADN bacteriene, cum ar fi bacteriofagii E. coli T4, T6, T7 și T3, codifică propriile ligaze ADN dependente de ATP. LIGAZELE ADN dependente de ATP sunt, de asemenea, codificate de virusurile ADN eucariote care conduc o parte sau tot ciclul lor de replicare în citoplasmă. Acestea includ virusul vaccinia, virusul pestei porcine africane și virusul Chlorella PBCV1. Bacteriofagul și ligazele ADN virale eucariote sunt mai mici decât omologii lor celulari., Vaccinia ADN-ul ligase, un 552-amino acid polipeptidic, este izbitor de asemănătoare la aminoacizi-secvență nivel la mamifere ADN-ul ligase III. Într-adevăr, ligase III este mult mai strâns legată de vaccinia ligase decât la mamifere ligazele I și IV. La ligazele de T4 (487 aminoacizi), T7 (359 aminoacizi), T3 (346 aminoacizi), și Chlorella virus (298 aminoacizi) sunt mai mici. Am arătat că ligaza virusului Chlorella poate completa creșterea unei tulpini de drojdie în care gena ADN ligaza i a fost eliminată., Acest rezultat sugerează că segmentele proteice unice pentru ligaza ADN mult mai mare I nu sunt esențiale pentru creșterea celulelor de drojdie.am examinat interacțiunea dintre ligazele eucariote și ADN folosind ca modele enzimele codificate de virus. Ligaza ADN a virusului Vaccinia și ligaza ADN a virusului Chlorella formează fiecare un complex discret cu un ligand ADN separat, în absența magneziului, care poate fi rezolvat din ADN-ul liber prin electroforeza în gel a poliacrilamidei native., Ligazele virale nu formează complexe stabile cu următorii liganzi: (i) ADN care conține un decalaj de 1-nucleotidă sau 2-nucleotidă; (ii) produsul ADN duplex sigilat al reacției de ligare; (iii) un duplex separat care conține un terminus 5′-OH la nick în loc de un 5′-fosfat; sau (iv) un duplex separat care conține un fir ARN pe partea 5′-fosfat a nick (10 până la 15). Astfel, LIGAZELE ADN dependente de ATP virale au o funcție intrinsecă de detectare a nick-ului.,

Nick recunoașterea de către vaccinia ADN-ul ligase și Chlorella virus ADN-ul ligase, de asemenea, depinde de ocupare a AMP obligatorii de buzunar pe enzimă — de exemplu, mutațiile de ligase-ul activ care elimina capacitatea de a forma ligase-adenilat intermediar elimina, de asemenea, nick recunoaștere; întrucât o mutație care păstrează ligase-adenilat formarea dar inactiveaza aval pași de strand aderarea reacție are nici un efect asupra legare la furat ADN-ul., Sechestrarea unei nucleotide extrahelice de către ligaza legată de ADN amintește de mecanismul „basic-flipping” de recunoaștere a site-ului țintă și cataliza utilizată de alte enzime de modificare și reparare a ADN-ului.deși fragmentul 5 ‘- fosfat este esențial pentru legarea ligazei virusului Chlorella de ADN-ul crestat, fragmentul 3′ – OH nu este necesar pentru recunoașterea nick-ului. Chlorella virus ligase se leagă de o furat ligand conțin 2′, 3′ dideoxy și 5′-fosfat termini dar nu pot cataliza adenylation de 5’-end., Astfel, 3 ‘ – OH este important pentru etapa 2 chimie, chiar dacă nu este ea însăși transformată chimic în timpul formării ADN-adenilat.pentru a delimita interfața ligază-ADN, am imprimat locul de legare a ligazei pe ADN. Mărimea amprentei exonucleazei III a ligazei legată de o singură nick în ADN-ul duplex este de 19 până la 21 de nucleotide. Amprenta este asimetrică, extinzând 8 până la 9 nucleotide pe partea 3′-OH a nick-ului și 11 până la 12 nucleotide pe partea 5’ – fosfat.,

structura cristalină a ADN-adenilat de ligază eucariotă

ligaza ADN a virusului Chlorella (ChVLig) este cea mai mică ligază dependentă de ATP eucariotă cunoscută. Ca ligază ADN „minimă”, a prezentat o țintă atractivă pentru determinarea structurii. Am cristalizat ChVLig și am determinat structura sa la rezoluția 2 Å. Enzima constă dintr-un domeniu nucleotidiltransferază n-terminal mai mare (NTase) și un domeniu OB Terminal C mai mic, cu o despicare între ele. O parte AMP a fost legată covalent de Nz de Lys27 la site-ul activ., Astfel, avem structura unui intermediar catalitic autentic.

în Cadrul NTase domeniu este o adenilat obligatoriu buzunar compus din șase peptide motive (I, Ia, III, IIIa, IV și V) care definesc covalente nucleotidyltransferase enzimă superfamiliei care include ADN și ARN ligazele și arnm plafonarea enzime. Motivul I (KxDGxR) conține lizina la care AMP devine legată covalent în prima etapă a reacției ligazei. Aminoacizii din motivele Ia, III, IIIa, IV și V contactează AMP și joacă roluri esențiale în una sau mai multe etape ale căii de ligare., Domeniul OB constă dintr-un butoi beta antiparalel cu cinci catenare plus o helix alfa.

Structurale de Baza pentru Nick Recunoașterea de către un Minim „Pluripotente” ADN-ul ligase

Deși ChVLig nu are mare N – sau C-terminal de însoțire domenii găsit în eucariote ADN-ul celular ligazele, se poate susține mitotic creștere, repararea ADN-ului, și nonhomologous end aderarea în devenire drojdie, atunci când acesta este singura sursă de ligase în celulă. ChVLig poate îndeplini chiar funcțiile esențiale ale lig3 de mamifere în metabolismul ADN-ului mitocondrial., Ne-am propus ca ChVLig reprezintă o dezbrăcat în jos „pluripotente” ligase datorită sale intrinseci nick detectare funcție, în baza cărora a fost iluminată atunci când am rezolvat 2.3 Å structura de cristal de ChVLig-AMP legat de un 3′-OH/5′-PO4 nick în ADN-ul duplex.

ChVLig înconjoară ADN-ul ca o clemă de proteine în formă de C. Domeniul NTase se leagă de firele ADN rupte și intacte din canelura majoră care flancează nick-ul și, de asemenea, în canelura minoră de pe partea 3′ – OH a nick-ului. Domeniul OB se leagă de-a lungul canelurii minore de pe fața duplexului din spatele nick-ului., Un nou modul „latch” -format dintr – o buclă beta-ac de păr care emană din domeniul OB-ocupă canelura majoră și completează clema circumferențială prin contactele dintre vârful buclei și suprafața domeniului NTase. Zăvorul este esențial pentru închiderea clemei și este un factor determinant al detectării nick-ului.

Compararea structurilor cristaline ale amplificatorului chvlig liber și legat de nick dezvăluie o rearanjare mare a domeniului care însoțește recunoașterea nick-ului., În CHVLIG-AMP liber, domeniul OB este reflectat departe de domeniul NTase pentru a expune complet suprafața de legare a ADN-ului deasupra buzunarului de legare a amplificatorului. Segmentul peptidic care este destinat să devină zăvorul este dezordonat în ligaza liberă și sensibil la proteoliză. Dar acest segment este protejat de proteoliză atunci când ChVLig se leagă de ADN-ul crestat. Legarea ADN implică o rotație de aproape 180 a domeniului OB în jurul unui pivotant, astfel încât suprafața concavă a barilului beta ob se potrivește în canelura minoră a ADN-ului., Această tranziție provoacă o mișcare de 63 Å a domeniului OB și plasează zăvorul adânc în canelura majoră a ADN-ului.

O rețea de interacțiuni cu 3′-OH și 5′-PO4 termini în site-ul activ iluminate ADN-ul adenylylation mecanism și critică rolul AMP in nick-detectare și cataliză. Adăugarea unui cation bivalent a declanșat etanșarea nick în crystallo, stabilind astfel că complexul nick este un intermediar de bună credință în calea de reparare a ADN-ului.,

structura ligazei ADN dependente de NAD + legată de Adenilatul ADN-ului nad+dependent (denumită LigA) este o cladă distinctivă și omogenă din punct de vedere structural de enzime găsite în toate bacteriile. E. coli LigA (671-aa) este prototipul acestei familii. LigA are o arhitectură modulară construită în jurul unui nucleu ligase central compus dintr-un domeniu NTase și un domeniu OB. Nucleul este flancat de un domeniu N-terminal „Ia” și trei module C-Terminale: un tetracisteină zinc-deget, un domeniu helix-ac de păr-helix (HhH) și un domeniu BRCT., Fiecare etapă a căii de ligare depinde de un subset diferit al domeniilor LigA, numai domeniul NTase fiind necesar pentru toți pașii. Domeniul Ia este unic pentru ligazele dependente de NAD+, este responsabil pentru legarea părții NMN a NAD+ și este necesar pentru reacția cu NAD+ pentru a forma intermediarul ligase-AMP.am constatat că ligaza ADN E. coli dependentă de NAD+poate susține creșterea tulpinilor Saccharomyces cerevisiae șterse individual pentru CDC9 sau dublu pentru CDC9 plus LIG4., Aceasta este prima demonstrație că o enzimă dependentă de NAD+este activă biologic într-un organism eucariot. Studii ulterioare (în colaborare cu Maria Jasin) a arătat că E. coli LigA ar putea fi suficientă pentru ligase funcție în mouse-ul ES celule lipsite esențiale Lig3 enzime.

structura noastră cristalină a E. coli LigA legată de intermediarul ADN-adenilat ciupit a arătat că LigA înconjoară și helixul ADN ca o clemă de proteine în formă de C. Interfața proteină-ADN implică contacte ADN extinse prin domeniile NTase, OB și HhH pe un segment 19-bp de ADN duplex centrat pe nick., La NTase domeniu se leagă de rupt ADN-ului la și de însoțire nick, OB domeniu contacte continuă șablon strand din jurul nick, iar HhH domeniu se leagă de ambele componente pe minor groove la periferia amprentei. Modulul Zn-finger joacă un rol structural în corelarea domeniilor OB și HhH. Domeniul Ia nu face contacte cu duplexul ADN, în concordanță cu dispensabilitatea sa pentru cataliza închiderii firului pe un substrat AppDNA.,

LigA NTase și OB domenii sunt poziționate în mod similar ADN-ul circumferinta la NTase și OB domenii de ATP-dependente de ADN ligazele, și-au „amprenta” similare segmente ale ADN-ului. Încă topologia LigA clema este complet diferit de cleme format de ChVLig omului și ADN-ul ligase 1 (HuLig1, determinată de Tom Ellenberger și colegii). Contactele kissing care închid clema LigA sunt sui generis, implicând domeniul NTase și domeniul HhH C-terminal., Pe baza datelor structurale disponibile, este clar că LIGAZELE ADN au evoluat cel puțin trei mijloace diferite de încercuire a ADN-ului.

Comparații de E. coli LigA—AppDNA complex cu structuri din alte bacteriene ligazele capturat ca binar LigA•—NAD+ complex (pasul 1 substrat), binar LigA•—NMN complexe (post-pasul 1 lăsând grup), și covalente ligase-AMP intermediar (etapa 1 produs după ce a părăsit grupul disociere) evidenția masive de proteine domeniu rearanjamente (de ordinul a 50 la 90 Å) care apar în sincronizare cu substrat obligatoriu și cataliză., ADN de legare și prindere formarea de LigA presupune o aproape 180 de rotație a OB domeniu, astfel încât suprafața concavă a OB beta butoi se potrivește în minor groove, similar cu ceea ce este văzut sau deduse pentru ChVLig și HuLig1. Legarea în patru puncte a domeniului HhH la periferia amprentei LigA-ADN stabilizează o îndoire a ADN-ului centrată la nick. LigA ADN-interacțiuni imediat flanchează nick induce un local denaturarea ADN-ul, care rezultă din adoptarea unui ARN-ca O formă de helix, din nou, reluând concluziile pentru HuLig1 ADN-cocrystal.,

Mecanism de lizină adenylylation de ATP-dependente și NAD+-dependente polinucleotide ligazele

auto-adenylylation reacție de polinucleotide ligazele este efectuată de către un nucleotidyltransferase (NTase) domeniu care este conservat în ATP-dependente de ADN și ARN ligazele și NAD+-dependente de ADN ligazele. Domeniul NTase include definirea motivelor peptidice care formează buzunarul de legare a nucleotidelor. Motivul I (KxDG) conține lizina care devine atașată covalent la amplificator. După cum a subliniat Robert Lehman în 1974, nu este clar modul în care lizina (cu o valoare PKA prezisă de ~10.,5) își pierde protonul la pH fiziologic pentru a atinge starea neprotonată necesară pentru atacul asupra fosforului α al ATP sau nad+. În principiu, ligase ar putea folosi o bază generală pentru a deprotona lizina. Alternativ, pKa ar putea fi condus în jos de potențialul de încărcare pozitivă a aminoacizilor proteici din jurul lizinei-NZ. Mai multe structuri cristaline ale ligazelor metale absente au oferit un sprijin redus pentru fiecare explicație. În aceste structuri, motivul i lizina nucleofil este situat lângă un motiv IV glutamat sau aspartat lanț lateral., Lizina și carboxilatul motiv IV formează o pereche de ioni, al cărei efect anticipat este creșterea pKa a lizinei în virtutea încărcării negative înconjurătoare. Este puțin probabil ca un anion glutamat sau aspartat ar putea servi ca bază generală pentru a abstractiza un proton din cationul lizinei. O soluție potențială a problemei ar fi dacă un cation bivalent se învecinează cu lizina-Nz și conduce în jos pKa.,

Un metal condus de mecanism a fost descoperit de către noastră recentă structură cristalină de Naegleria gruberi ARN-ul ligase (NgrRnl), ca un pas 1 Michaelis complexe cu ATP și mangan (de preferat din metal cofactor). Cheia pentru capturarea complexului Michaelis a fost înlocuirea nucleofilului lizinei cu o metionină izosterică. Structura 1.9 Å conținea ATP și doi ioni de mangan în situsul activ. Metalul „catalitic” a fost coordonat cu geometria octaedrică la cinci ape, care au fost la rândul lor coordonate de lanțurile laterale carboxilate de reziduuri conservate în motivele I, III și IV., Cel de-al șaselea situs ligand din complexul metalic catalitic a fost ocupat de un oxigen ATP α fosfat, care indică un rol pentru metal în stabilizarea stării de tranziție a reacției de auto-adenililare. O cheie de înțelegere, îmbogățit prin suprapunerea de Michaelis complexe asupra structurii covalente NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP intermediare, respectiv rolul catalitic metalice complexe în stabilizarea onu-protonate stat de lizină nucleofil înainte de a cataliza, prin intermediul locală de sarcină pozitivă și atomice de contact de Lys-Nz cu unul de metal legat de ape., Complexul Ngrrnl Michaelis a dezvăluit un al doilea metal, coordonat octaedral la patru ape și la ATP β și γ fosfat oxygens. Complexul metalic și fosfatul ATP γ au fost angajate de un ansamblu de lanțuri laterale de aminoacizi (unice pentru NgrRnl) care orientează colectiv PPi lăsând grupul apical la nucleofilul lizinei. În concordanță cu un mecanism în linie cu o singură etapă, fosfatul α a fost inversat stereochimic în timpul tranziției de la complexul Ngrrnl•ATP Michaelis la intermediarul lysyl-AMP.,

ADN ligazele au evoluat separat de ARN ligazele, inițial prin fuziune a unei ancestrale ATP-utilizarea NTase domeniu C-terminal OB domeniu (să cuprindă minim catalitic bază de ADN ligaze), și, ulterior, prin fuziunea structurale suplimentare module la NTase-OB core (7). NAD+-dependente de ADN ligazele (LigA enzime), care sunt omniprezente în bacterii și esențiale pentru viabilitatea bacteriană, dobândite specificitatea lor pentru NAD+ prin fuziune a unei NMN-obligatoriu Ia domeniu modulul de la N-terminus al NTase domeniu., Escherichia coli ADN ligase (EcoLigA) a fost prima ligază ADN celulară descoperită și caracterizată și rămâne modelul principal pentru studiile structurale și funcționale ale familiei de ligaze ADN dependente de NAD+. Interesul pentru mecanismul LigA este propulsat de promisiunea de a viza LigA (prin semnătura sa nad+ specificitatea substratului și caracteristicile structurale unice față de ligazele ADN umane) pentru descoperirea medicamentelor anti-bacteriene. am rezolvat o structură cristalină EcoLigA de 1,55 Å ca un complex Michaelis cu nad+ și magneziu., Structura dezvăluie un singur mecanism metalic în care un ligase legat de Mg2+(H2O)5 complexe reduce lizina pKa și angajează NAD+ α fosfat, dar β fosfat și nicotinamida nucleozidici de NMN lăsând grup sunt orientate exclusiv prin intermediul atomice interacțiuni cu elementele de proteine, care sunt unice pentru LigA clade. Dihotomia cu două metale (pentru ligaza dependentă de ATP) versus un metal (pentru ligaza dependentă de NAD+) delimitează un punct de ramificație în evoluția ligazei.