după ce a studiat la RADA din 1992 până în 1995, Macfadyen a devenit cunoscut în Teatrul britanic în primul rând pentru munca sa cu compania de scenă Cheek by Jowl, pentru care a jucat Antonio în Ducesa de Malfi, Charles Surface în școala pentru Scandal și Benedick în Much Ado About Nothing. Benedick lui a fost jucat ca un bufon ofițer de clasă cu o mustață și un râs braying. În 2005, l-a interpretat pe Prințul Hal în Henric al IV-lea, părțile unu și doi la Teatrul Național Regal, cu Michael Gambon în rolul Falstaff., În 2007, s-a întors pe scenă, înfățișând un american, Clay, un tată acasă, cu o atitudine liberală în piesa The Pain and the Itch.o descoperire TV a apărut atunci când a apărut ca Hareton Earnshaw într-o adaptare a Wuthering Heights, ecranizată pe rețeaua ITV în 1998. Au urmat alte lucrări de teatru de televiziune, inclusiv roluri principale în dramas Warriors (1999) și The Way We Live Now (2001), ambele pentru BBC. Tot în 2001, a câștigat aprecierea pentru rolul său principal în serialul de dramă BBC Two Perfect Strangers, care a fost scris și regizat de Stephen Poliakoff., În 2002, el a jucat în proiect, o dramă BBC cartografierea ascensiunea New Labour la putere. A jucat în Spooks, care a devenit un succes atunci când a fost ecranizat pe BBC One. Un al doilea sezon mai lung a fost proiectat în 2003, iar un al treilea sezon a fost difuzat în toamna anului 2004, cu el părăsind seria în al doilea episod. Seria a fost difuzată ca MI-5 pe rețeaua a&E. În 2007 a apărut în drama One-off Channel 4 Secret Life, care sa ocupat de subiectul controversat al pedofiliei., Macfadyen a câștigat premiul pentru cel mai bun Actor la Premiile Royal Television Society 2007 pentru această parte și a fost nominalizat la BAFTA. El a apărut, de asemenea, într-o scurtă schiță pentru Comic Relief ca mirele în nunta domnului Bean, alături de Rowan Atkinson și Michelle Ryan.

Macfadyen a apărut în filme, inclusiv Enigma (lansat în 2001), și În Tatăl Meu e Den, pentru care a primit Noua Zeelandă Ecran Premiul pentru cel Mai bun Actor., El a jucat rolul romanticului Fitzwilliam Darcy într-o adaptare a Pride and Prejudice, lansată în Marea Britanie în septembrie 2005.Macfadyen a jucat în moartea lui Frank Oz la o înmormântare și în filmul incendiar, bazat pe romanul lui Chris Cleave alături de Michelle Williams și Ewan McGregor. A apărut și în filmul lui Ron Howard Frost/Nixon, în care l-a interpretat pe John Birt. În 2008, a jucat rolul principal masculin Arthur Clennam în adaptarea BBC a micului Dorrit al lui Charles Dickens., În 2009, Macfadyen a apărut alături de actrița Helena Bonham Carter, nominalizată la Oscar, în filmul BBC Four Enid, bazat pe viața lui Enid Blyton, ca Hugh Pollock, editorul și primul soț al lui Blyton.în 2010, a jucat șeriful din Nottingham în Robin Hood. A jucat ca Prior Philip în serialul TV The Pillars of the Earth și a fost Logan Mountstuart de vârstă mijlocie în orice inimă umană. În iunie 2010, Macfadyen a câștigat un premiu de televiziune al Academiei Britanice pentru cel mai bun Actor în rol secundar pentru munca sa în justiția penală.,în 2011, Macfadyen a făcut un cameo final în emisiunea BBC Spooks, iar în 2012, a jucat Oblonsky în filmul lui Joe Wright, Anna Karenina. În decembrie 2012 a început să-l portretizeze pe inspectorul detectiv Edmund Reid în BBC One ‘ s Ripper Street.în 2013-14 a jucat Jeeves în producția lui Jeeves și Wooster în Perfect nonsens la Teatrul Duke Of York din West End Of London. Piesa a câștigat premiul Olivier 2014 pentru cea mai bună comedie nouă.în 2015, Amazon Prime a preluat Ripper Street și, după recenzii bune, a fost repus în funcțiune pentru al patrulea și al cincilea sezon., Macfadyen a spus că a fost „încântat să se îmbarce într – o altă doză de Ripper Street-sânge și intestine, Ceasuri de buzunar și pălării victoriene, minunat întunecate, linii de poveste în mișcare și misterioase de la Domnul Richard Wardlow”. Serialul a fost difuzat și în SUA pe BBC America. Tot în 2015, el a jucat în episodul pilot al ultimului regat.în prezent joacă rolul lui Tom Wambsgan în serialul HBO Succession, pentru care a primit o nominalizare la Premiul Primetime Emmy.,în 2020, a apărut în rolul maiorului Charles Ingram într-o dramă ITV în trei părți, Quiz, bazată pe controversatul scandal de înșelăciune a tusei despre cine vrea să fie milionar în 2001.