Design sintetice acetil-CoA cale

Cel mai simplu mod de a sintetiza carbon organic din una-carbon este de a construi de unul singur., Pentru a construi o cale artificială acetil-CoA dintr-un carbon, am propus calea sintetică acetil-CoA (Saca), unde două molecule de formaldehidă ar fi transferate într-o moleculă de acetil-CoA prin doar trei etape (Fig. 1a). În primul rând, formaldehida ar fi condensată în glicolaldehidă (GALD) de către sintaza glicolaldehidă (GALS). Și apoi glicolaldehida ar fi transformată în acetil-fosfat (AcP) de către acetil-fosfat sintetază (ACPS) folosind fosfat anorganic. În cele din urmă, AcP ar fi utilizat pentru a produce acetil-CoA de către enzima cunoscută fosfat acetiltransferază (PTA)25., Între timp, formaldehida poate fi obținută prin reducerea dioxidului de carbon și a formatului26 sau prin oxidarea metanului și a metanolului27. Astfel, am putea realiza biosinteza acetil-CoA din formaldehidă și chiar și alte resurse de carbon.

termodinamicii poate reflecta fie o cale ar putea fi efectuată în mod eficient în vivo sau în vitro. Am calculat forța motrice chimică termodinamică a căii proiectate SACA., Reacția generală de la formaldehidă la acetil-CoA este foarte favorabilă termodinamic, unde schimbarea totală a energiei Gibbs (ΔrG ‘ m) a întregii reacții este de aproximativ -96,7 kJ mol−1 (Fig. 1b și tabelul suplimentar 1). Valoarea MDF (forța motrice maximă) este de obicei utilizată pentru a evalua calitatea termodinamică și cinetică a diferitelor căi de acces28. Dacă MDF-ul este suficient de ridicat, calea nu conține blocaje termodinamice care ar împiedica funcționarea sa in vivo. Calea saca a obținut valoarea MDF relativ ridicată de 26.,9 kJ mol-1, Care este în mod evident mai mare decât căile FLS și MCC (valorile lor MDF sunt 1.9 și 5.8 kJ mol−1, respectiv). Prin urmare, calea SACA este termodinamic favorabilă biosintezei acetil-CoA din formaldehidă.

identificarea unei enzime noi de la C1 la C2

condensarea formaldehidei poate fi catalizată de carabina n-heterociclică în chimie29,30. În biologie, thiazolium inel de cofactor tiamina difosfat (ThDP) are funcție similară, care ar putea activa o aldehidă și apoi, sub forma de dimer cu un alt aldehyde31., În scopul de a găsi o enzimă pentru condensarea a două molecule de formaldehidă într-o moleculă de glycolaldehyde, ne-am referit la mecanismele catalitice de ThDP enzimelor dependente și a construit o theozyme model, care include ThDP, glycolaldehyde, și acid glutamic care furnizează electroni pentru reaction32 (Fig. 2a). Toate enzimele din Protein data Bank (PPB), practic au fost analizate pe baza theozyme model și 37 de non-redundante structuri proteice cu ligand ThDP au fost atinse (Suplimentare Fig. 1 și nota suplimentară)., În funcție de mecanismele catalitice de ThDP-dependente enzymes33,34,35, C2 atom în ThDP este centrul activ. Distanța dintre atomul C2 și produsul glicolaldehidei este critică pentru declanșarea reacției catalitice (Fig. 2a). Astfel, am analizat distanța dintre atomul C2 și glicolaldehida în fiecare proteină candidată.

Bazează pe distanțe medii în fiecare proteina folosind molecular docking (Date Suplimentare 1)36, șase candidați cu distanțe scurte și clare funcționale adnotări au fost definite ca fiind candidați (Fig. 2b și tabelul suplimentar 2). În plus, trei proteine cu distanțe lungi au fost alese aleatoriu ca controale. Candidații și controalele au fost exprimate și purificate pentru a testa capacitatea lor de a produce glicolaldehidă din formaldehidă., Trei din șase candidați au prezentat activitatea dorită, în timp ce trei controale nu au avut funcția, indicând distanța dintre atomul C2 și glicolaldehida joacă un rol critic în condensarea formaldehidei. Printre active trei candidați, proteine 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1), care a fost numit benzaldehida liază (BAL), a fost raportat în mod preferențial de a genera dihidroxiacetona (DHA), în ciuda minime de randament din glycolaldehyde atunci când concentrația de formaldehidă a fost lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,deoarece BAL a fost proiectat pentru a produce DHA din formaldehidă22, am propus să detectăm dacă mutațiile corespunzătoare în BFD ar contribui, de asemenea, la îmbunătățirea activității enzimatice (Fig suplimentar. 2). Prin examinarea tuturor reziduurilor mutante, am găsit într-adevăr o mutație foarte activă W86R-N87T care a fost localizată în canalul de substrat al BFD (Fig suplimentar. 3). Astfel, această mutație (W86R-N87T) a fost introdusă în BFD și varianta a fost marcată ca M1., Pentru a îmbunătăți și mai mult activitatea catalitică a BFD, am propus să examinăm toate reziduurile din jurul centrului activ al BFD, unde 25 de poziții aflate la o distanță de 8 Å față de centrul activ au fost selectate pentru a face mutageneză de saturație cu un singur punct (Fig suplimentar. 4). Am dezvoltat o abordare de screening cu debit mare pentru a detecta glicolaldehida prin reacția de culoare între glicolaldehidă și difenilamină, care a fost măsurată prin monitor spectrofotometric la 650 nm (Fig suplimentar. 5)., După screening, am constatat că 14 din 25 de poziții au prezentat activități mai mari decât mutantul M1 (Fig suplimentar. 6). Ulterior, 14 posturi au fost împărțite în 8 grupe: O (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), și H (T379/T380). N27 a fost utilizat de trei ori, deoarece variantele din această poziție au afișat cea mai mare activitate. Folosind M1 ca șablon, am introdus fiecare grup de mutații în M1 și am selectat cel mai mare mutant activ, care a fost etichetat ca M2., Prin efectuarea a trei runde de mutageneză combinatorică iterativă printre aceste poziții, am analizat total 64.512 clone și am obținut un mutant cu activitate ridicată care conține cinci mutații noi în jurul centrului activ. În cele din urmă, varianta cu 7 mutații reziduale a fost numită glicolaldehidă sintază (GALS). Kcat-ul GALS a fost îmbunătățit de aproximativ 160 de ori, iar eficiența catalitică finală a GALS este de 9,6 M−1·s−1, Care este de aproximativ 70 de ori mai mare decât enzima inițială (Fig. 3a și suplimentar Fig. 7).

pentru a afla cum aceste mutații îmbunătățesc activitatea enzimatică, am propus refacerea cristalizării GALS. Buzunarul activ localizează la interfața homodimerului GALS38., Structura proteică a GALS poate diferi de proteina inițială după mai multe runde de mutație. Aici, am cristalizat proteina GALS și am recuperat structura cristalină a GALS folosind structura BFD ca model de căutare (tabelul suplimentar 3). A fost analizată structura cristalină a fetelor (Fig. 8, Suplimentar Fig. 9). Am constatat că mutația de L110E introduce alte două legături de hidrogen cu grupare hidroxil de intermediar analog (IMA), care pot contribui la stabilizarea stare de tranziție și scindarea legăturii C–C între produs și cofactor ThDP (Fig. 3b)., Mutația L109G a mărit volumul buzunarului de legare a substratului prin înlocuirea grupării izobutil mari cu o grupare hidrogen. A treia mutație a A460M poate reorienta substratul și apoi poate spori interacțiunea dintre ThDP și substrat. Ultimele două mutații H281V și Q282F au extins raza porilor suprafeței exterioare și pot facilita accesul substratului sau produsului (Fig. 3c). Comparativ cu M1, volumul buzunarului de reacție la GALS a fost mărit cu mai mult de 30%, ceea ce ar fi principalul motiv pentru îmbunătățirea activității catalitice.,

identificarea sintazei acetil-fosfat

în natură, nu s-a raportat nicio enzimă care să realizeze sinteza AcP din glicolaldehidă. Phosphoketolases (PKs) poate produce AcP din fructoză-6-fosfat (F6P) sau xylulose-5-fosfat (X5P)39. În funcție de mecanismul catalitic al PKs, este posibil ca glycolaldehyde interacționează cu ThDP și apoi generează 2-α,β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4A), care este intermediarul cheie al formării AcP de la F6P sau X5P de PKs. Pentru a confirma ipoteza noastră, am selectat opt candidați (Fig., 4B) pe baza arborelui filogenetic al PKs din 111 familii de bacterii (suplimentar Fig. 10). După sinteza genelor și purificarea proteinelor (suplimentar Fig. 11), am examinat activitatea catalitică a tuturor proteinelor candidate care utilizează glicolaldehida ca substrat. Din fericire, cinci din opt PK-uri au prezentat activități catalitice semnificative. Doar PK1, PK4 și PK8 nu au prezentat diferențe semnificative față de controlul gol. Astfel, PK2 cu cea mai mare activitate a fost denumită acetil-fosfat sintază (ACPS), a cărui kcat/Km atinge 3,21 M−1·s−1 (fig suplimentar. 12).,

Pentru a descoperi mecanismul de formare a DHEThDP de glycolaldehyde, ne-am propus pentru a efectua analize teoretice bazate pe precedent model de calcul PK40. Toți aminoacizii posibili legați de formarea DHEThDP au fost utilizați pentru a construi modelul computațional (Fig suplimentar. 13)., Bazat pe calcul de simulare, am constatat că bariera de energie este de numai 11.36 kcal mol−1 pentru formarea IM1 (intermediar 1) atunci când glycolaldehyde fost protonate de His553, care a fost considerat ca cel mai posibil proton donor40 (Fig. 4c). Apoi, IM1 tautomerizes în IM2 cu ajutorul Glu479 și Glu437. IM2 este mai stabil din punct de vedere energetic decât IM1. Când protonul IM2 a fost dezbrăcat de N4 ‘ în ThDP, bariera energetică de la IM2 la DHEThDP-ul intermediar cheie este 15.,13 kcal mol−1, care este la fel de similare ca energia de deformare în timpul formării DHEThDP folosind F6P ca substrate40. După formarea DHEThDP, următoarele procese catalitice sunt aceleași ca și alte PKs (Fig suplimentar. 14), adică, H97 acționează ca donator de protoni de deshidratare procesul de DHEThDP, și His142 și Gly155 accelera procesul de deshidratare a DHEThDP, judecând după faptul că His142 și Gly155 forma legături de hidrogen cu moleculele de apă în structura de post-deshidratare intermediar (AcThDP)., His64, Tyr501, și Asn549 sunt importante pentru atac nucleofil de Pi și au, împreună, formează situsul de legare al Pi39. Experimentele de mutageneză direcționate pe situs au indicat, de asemenea, că aceste reziduuri sunt pivot pentru activitatea enzimatică (Fig suplimentar. 15).

sinteza acetil-CoA din formaldehidă in vitro

cu designul inițial de succes al GALS și ACPS, am intenționat să construim calea SACA in vitro pentru a sintetiza acetil-CoA din formaldehidă. În primul rând, am măsurat randamentul glicolaldehidei de către fete sub diferite concentrații de formaldehidă., Rezultatele au arătat că GALS poate cataliza în mod eficient dimerizarea formaldehidei, iar randamentul glicolaldehidei a crescut odată cu îmbunătățirea concentrației substratului (Fig. 5a). De exemplu, randamentul glicolaldehidei din formaldehidă a crescut de la 45% la 0,5 g L−1 la 80% la 2 g l−1. În al doilea rând, am examinat eficiența catalitică de la glicolaldehidă la AcP, care a fost cuantificată prin conținutul de acid acetic, deoarece AcP ar fi rapid degradat în acid acetic (Fig suplimentar. 16)23., Rezultatele au arătat că randamentul AcP a ajuns la mai mult de 80% în concentrații diferite de glicolaldehidă prin ACPS (Fig suplimentar. 17). Din păcate, ACPS a fost evident inhibat de formaldehidă (Fig. 5b). Astfel, este necesar să se ia un echilibru pentru concentrația de formaldehidă în rezolvarea acestui conflict.

pentru a optimiza concentrația de formaldehidă, a fost efectuat un experiment cu gradient utilizând sistemul de reacție care conține 2 mg mL−1 de GALS și ACPS. Odată cu creșterea concentrației de formaldehidă, randamentul acidului acetic în sistem a crescut inițial și apoi a scăzut (Fig. 5c). Când concentrația de formaldehidă este de 1 g L−1, randamentul acidului acetic a ajuns la 50,6%., Interesant este că randamentul final al acidului acetic este chiar mai mare decât cel din sistemul de reacție de la glicolaldehidă la AcP cu aceeași cantitate de formaldehidă (Fig. 5B, gri-linie). Acest lucru ar fi cauzat de eliberarea parțială a funcției ACPS, deoarece formaldehida a fost consumată treptat de GALS. Pe baza acestui sistem, am adăugat în continuare o altă enzimă cunoscută fosfat acetiltransferază (PTA), care ar transforma AcP în acetil-CoA. În cele din urmă, calea SACA a produs acetil-CoA de 5,5 mM la concentrația de formaldehidă de 1 g L−1. Randamentul acetil-CoA din formaldehidă a fost de aproximativ 33% (Fig. 5D)., Cu toate acestea, randamentul acidului acetic (7,8 mM) din formaldehidă (33,3 mM) a ajuns la 50% dacă PTA și CoA nu au fost furnizate. Randamentul mai mic al acetil-CoA decât cel al acidului acetic ar fi cauzat de instabilitatea acetil-CoA și AcP. Rezultatele noastre au indicat că este de succes pentru biosinteza acetil-CoA din formaldehidă prin calea SACA in vitro.,

Validarea SACA cale de 13C-etichetare

După stabilirea SACA cale cu enzime purificate in vitro, am încercat să testăm biosinteza de acetil-CoA și derivate din SACA cale in vivo de 13C-metabolice trasor teste (Fig. 6a). În primul rând, lizatele celulare au fost utilizate pentru a verifica biosinteza acetil-CoA prin adăugarea de formaldehidă marcată cu 13C și CoA. Am detectat o creștere semnificativă a acetil-CoA dublu marcat cu 13C față de alte controale (valoarea p < 0.001, T-test) (Fig. 6B și suplimentar Fig. 18)., Mai mult, creșterea dublei acetil-CoA marcată cu 13C a dispărut dacă am omis una dintre genele din calea SACA, cum ar fi ACPS și PTA (Fig suplimentar. 19). În plus, acetil-CoA ar fi convergent cu oxaloacetat pentru a intra în ciclul acidului tricarboxilic (TCA). Avem, de asemenea, detectat în mod semnificativ mai multe duble 13C-etichetate disoproxil (P-value < 0.001, T-test) și malat (P-value < 0.001, T-test) numai în tulpina cu SACA cale și 13C-etichetate formaldehidă de alimentare (Fig. 6B și suplimentar Fig. 18)., Cu toate acestea, nu am detectat diferențe semnificative în izotopomerii de masă de ordin superior. Aceasta ar fi cauzată de cantitatea redusă de izotopomeri dubli marcați cu 13C în ciclul TCA.

ulterior, am propus testarea fluxului de carbon în celule. Datorită toxicității de formaldehidă la celule, am introdus metanol dehidrogenazei din Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 pentru a menține un continuu scăzut concentrația de formaldehidă în vivo (Fig. 6a). Celulele cultivate au fost recoltate în diferite momente de timp și au fost utilizate pentru a detecta aminoacizii proteinogeni și metaboliții intracelulari (Fig. 6c)., Am constatat că tulpina cu calea SACA (BsMDH-SACA) conținea mai mult aspartat dublu marcat cu 13C și glutamat, care a derivat din ciclul TCA. În plus, 13C-etichetate glucoză și phosphoenolpyruvate, care ar putea genera la dublu 13C-etichetate oxaloacetat prin gluconeogeneză cale, au fost depistate mai mult în tulpina BsMDH-SACA decât cei din grupul de control tulpina (BsMDH-28a). Astfel, rezultatele noastre au indicat că calea SACA este funcțională pentru producerea metaboliților acetil-CoA și acetil-CoA derivați din formaldehidă.,

evaluarea căii SACA prin creșterea celulară

pentru a evalua în continuare calea SACA in vivo, am propus testarea treptată a creșterii celulare prin hrănirea fiecărui intermediar din cale. Inițial, E. coli a crescut sub mediul bogat și apoi glicolaldehida a fost adăugată ca sursă suplimentară de carbon. Prin adăugarea de concentrații diferite de glicolaldehidă (Fig suplimentar. 20), am constatat că tulpina proiectată care conține calea SACA cu mai mult de 0.,4 g de aprovizionare cu glicolaldehidă L-1 are OD600 remarcabil mai mare decât acele tulpini fără glicolaldehidă sau calea SACA (Fig . 7a și suplimentar Fig. 21). Contribuția glycolaldehyde pentru biomasă (celulare greutatea uscată, CDW) a fost 0.681 ± 0.028 gCDWg−1 (n = 3) glycolaldehyde.

când am testat creșterea celulelor folosind formaldehida ca sursă suplimentară de carbon, creșterea tulpinii cu vector gol a fost total inhibată de 80 mg L−1 de formaldehidă (Fig. 7b). Tulpina care conține calea SACA a fost inhibată inițial și apoi a crescut în mod normal în aceeași stare, care poate fi cauzată de rata sa mai rapidă de consum de formaldehidă decât tulpina cu vector gol (Fig suplimentar. 22)., Din păcate tulpina care conține calea SACA nu a avut mai multă biomasă cu supliment de formaldehidă decât cele fără formaldehidă. Aceste rezultate au indicat că, deși calea SACA este mai eficientă pentru îndepărtarea formaldehidei toxice, nu este suficient să se furnizeze biomasă.în cele din urmă, am intenționat să evaluăm calea SACA prin hrănirea metanolului, care ar fi transformat continuu în formaldehidă. Am constatat că tulpina care conține atât calea BsMDH, cât și calea SACA are OD600 mai mare decât acele controale fără alimentare cu metanol sau calea SACA (Fig. 7c și suplimentar Fig., 23). După 26 de ore de incubare, am constatat că valoarea OD600 în tulpina conține atât BsMDH și SACA cale crescut de aproximativ 0,2, care este semnificativ mai mare decât tulpina fără SACA cale (valoarea P = 0.005, T-test). Comparând cu tulpina fără calea saca, am constatat că cantitatea de biomasă derivată din metanol a fost de 0,03 ± 0,006 gcdw G−1 (n = 3) metanol în tulpina care conține calea saca.