00: 00: 05.21 Hello. Vou falar sobre a replicação semi-conservadora do ADN. Não tanto sobre os detalhes técnicos, mas sobre como Frank Stahl e eu
00:00:16.19 acabou fazendo a experiência que mostrou que o DNA
00:00:20.20 replica por duas cadeias desfazia,
00:00:23.10 cada um fazendo uma nova cópia e, em seguida, você tem dois,
00:00:27.10 cada um dos quais tem uma corrente antiga e uma nova.
00: 00: 30.,24It é difícil saber por onde começar qualquer história particular
00:00:34.06 mas deixe-me começar com a publicação, em 1953
00:00:38.00 do papel por Watson e Crick. Na verdade, havia dois trabalhos na natureza. A primeira foi sobre a estrutura
00: 00: 45.01 que foi baseada na construção do modelo e um pouco de informação da difração de raios X
00:50.15 a difração de raios X certamente não lhe disse a estrutura.00: 00: 54: 09 ele lhe disse algo sobre a distância repetida ao longo da hélice.ele disse que era uma hélice e muito pouco mais.
00: 01: 02.,O edifício modelo era o edifício modelo, então a estrutura certamente não foi provada.esta foi uma proposta e muitas pessoas não acreditaram nela.
00: 01: 13.10 The second paper proposed how the molecule might replicate. As duas cadeias separadas, cada guia em sua superfície
00:01:22.26 a formação de uma nova cadeia, então você
00:01:25.11 acabar com duas hélices, cada um tem
00:01:28.03 uma das antigas cadeias e uma marca nova cadeia.
00:01:30.23 que é chamado de replicação semi-conservadora.,
00: 01: 33.20 em Caltech, Max Delbruck que conhecia Jim Watson e estava em correspondência com ele
00: 01: 40.01 foi pessimista sobre este esquema de replicação.
00:01:44.05 pessimista sobre replicação semi-conservadora.as correntes eram enroladas em torno umas das outras, por isso, para separá-las, a menos que as quebrasse, teria de desembrulhar a dupla hélice básica para separar os dois braços.Max pensou que isso seria impossível, hidronamicamente impossível.
00: 02: 01.11 And so he proposed that maybe the two chains separated by a system of
00: 02: 05.,Quebrando cada um dos vários nucleótidos ao longo da cadeia. And he and Gunther Stent published a paper
00: 02: 12.17 which proposed three different methods for DNA replication.
00:02:15.27 Semi-conservador, como Watson e Crick tinham previsto,
00:02:19.29 conservador, em que pelo menos conceitualmente talvez houvesse
00:02:22.28 forma de uma dupla hélice poderia nortear a formação
00:02:26.09 outra dupla hélice, assim como nas proximidades
00:02:28.19 e para que você nunca teria para separar as correntes em todos os.
00: 02: 33.,01 you would have a brand new double helix and a completely old double helix, and that would
00: 02: 37.02 be the act of replication.
00: 02: 39.12 e, em seguida, dispersivo, a terceira maneira, quebrar as cadeias simples, separar as peças, e, em seguida, colocar tudo novamente juntos.visitei o Max no seu escritório. Eu estava em Química.
00:02:52.24 eu era um estudante de Linus Pauling.o Max estava acabado em Biologia, e ele me contou sobre este problema, e ocorreu-me que talvez alguém pudesse fazer um experimento para descobrir o modo de replicação do DNA.,04 com base na utilização de isótopos pesados.
00: 03: 08.15 eu gostaria de ter tempo para lhe dizer por que eu pensei sobre isótopos pesados
00:03:12.08 mas teve a ver com tomar um curso que foi um pedaço de sorte
00:03:16.11 curso de Linus Pauling sobre a natureza da ligação química.
00: 03: 19.10 in which deuterium and hydrogen bonds played an important role.
00: 03: 23.17 no entanto, a idéia era rotular o DNA com algo pesado,
00:03:29.00 eu não acho que eu pensei sobre, oh sim, era deutério que eu pensei na época.
00: 03: 33.,05Then para rotulá-lo através do crescimento de bactérias ou fagos
00:03:37.11 em meio denso, o deutério e o médio,
00:03:40.00 e, em seguida, mude o crescimento médio luz
00:03:42.15 e, em seguida, colocar tudo isso na centrífuga e olhar para ver onde o
00:03:45.20 DNA foi-até o topo se você ajustou a densidade de direito
00:03:49.12 se foi toda a luz, para baixo, para o fundo, se tudo foi pesado,
00:03:54.03 e no meio se ele estava meio pesado e meia luz.
00: 03: 57.05 é uma simplificação exagerada, mas foi assim que pensei sobre o experimento
00:04:01.09 naquela época., Isto foi por volta de 1954.
00:04:05.14 I then went to Woods Hole as a teaching assistant
00:04:08.25 for Jim Watson (he had lived at Caltech the previous term)
00:04: 14.02 in the physiology course.
00:04:17.13 E, um dia, como auxiliar de ensino em que o curso
00:04:20.17 Jim Watson e Sydney Brenner, que estavam ensinando o curso,
00:04:24.11 estavam em um quarto no andar de cima de um edifício chamado a Lillie edifício, a Marinha Biológica do Laboratório,
00:04:30.24 e Jim olhou através da janela e apontou para baixo em uma árvore
00:04:33.,18 sob o qual estava sentado um homem que era, você não podia dizer de longe, 00: 04: 38.05 mas ele estava vendendo gin tónico.
00:04:40.18 ele tinha um grande jarro de gin e uma grande coisa de tónico, e um pouco de gelo e alguns copos e algumas Limas,
00:04:45.22 e ele iria vender gin tónico para transeuntes, e com os lucros ele poderia comprar algum gin tónico para si mesmo.
= = ligações externas = =
00:04:53.29 mas Jim estava dizendo que este cara pensava muito de si mesmo,
00:04:57.15 então vamos dar-lhe uma experiência realmente difícil de fazer na aula de Fisiologia,
00:05:02.,O famoso experimento Hershey-Chase feito por duas pessoas ao longo de um período de tempo, Hershey e Chase, e ver se Stahl poderia fazer tudo em uma tarde. Bem, eu achei que era muito mau para se juntar a este pobre tipo então fui lá e apresentei-me a ele e disse-lhe o que estava reservado para ele.
00: 05: 18.07 e ele me disse o que ele estava fazendo em phage genetics
00:05:21.07 e que ele estaria na Caltech no ano seguinte.
00: 05: 23.28 então concordamos em tentar fazer este experimento juntos, nós mesmos, sobre como o DNA se replica
00:05:29.,03 quando chegou à Caltech. Eu tinha que terminar meu cristalografia de raios-X primeiro
00:05:33.25 antes de Frank iria vamos começar porque ele disse que seria ruim para o meu personagem para ir em frente e começar de algum novo projeto
00:05:40.14 quando eu não tinha terminado o meu trabalho de tese,
00:05:43.03 que foi cristalografia de raios-X.finalmente fiz a cristalografia de Raio-X e podíamos começar a experiência.
00:05:505 Frank e eu decidimos que devemos desenvolver o método
00: 05: 52.26 para fazer esta centrifugação gradiente de densidade
00: 05: 55.,Assim, passamos muito tempo, mais de um ano, desenvolvendo um método que poderia separar macromoléculas em um gradiente de densidade.e para fazer isso colocamos em DNA puro em uma centrifugadora e a ligamos para ver o que estava acontecendo e para nosso espanto um gradiente de densidade estava se formando.
00: 06: 16.14 isto foi porque o íon césio é bastante pesado, bastante denso, e ele
00:06:22.10 tende a se estabelecer para o fundo em um poderoso campo centrífugo
00:06:26.,09 e a difusão quer que volte para cima para redistribuí-lo
00:06:29.25 e em equilíbrio você tem um gradiente de densidade em que há mais cloreto de césio
00:06:34.25 perto do fundo do que perto do topo.
00: 06: 36.27 e assim o gradiente de densidade forma automaticamente.não esperávamos isto.nós vimos isso acontecer, nós pensamos que teríamos que fazer um gradiente de Densidade Pré-formado na célula centrifugadora mas a própria centrifugadora faz o gradiente de densidade.
00: 06: 51.,Para abreviar uma longa história, nós cultivamos bactérias em meio nitrogênio pesado
00: 06: 57.14 e depois de muitas gerações de crescimento, de modo que tudo seria rotulado com nitrogênio pesado, nós trocamos as bactérias, centrifugando-as e ressuspendendo-as
00:07:07.25 em um meio leve e colhemos amostras em vários momentos.o primeiro experimento que Frank me avisou que eu misturaria se eu fizesse as duas direções ao mesmo tempo, se eu fizesse pesado para leve e leve para pesado.e eu disse, “não, vou codificar os tubos”, e misturei-os completamente.
00: 07: 25.,25só não era claro exatamente quais tubos eram quais. The second experiment
00:07:30.28 we labeled experiment number one and that is what we published,
00: 07: 35.14 along with experiment number 2, which was a repeat.
00: 07: 38.23 And what we found of course was that
00:07:42.09 the bacteria at one generation had only one kind of DNA.
00: 07: 46.25 tinha uma densidade a meio caminho entre pesado e leve.
00: 07: 49.26 e na segunda geração bacteriana, havia dois tipos de DNA,
00:07:53.19 meio pesado, e totalmente leve.
00: 07: 56.27 agora nós tivemos que escrever este artigo., Na verdade, fomos bastante lentos ao escrevê-lo.00:08:01.06 e então Max Delbruck levou-nos ao laboratório da Marinha. 00:08:04.26 em Corona del Mar, e trancou-nos numa sala de torre.
00:08:08.00 ele literalmente fez. Mary Delbruck, esposa de Max, trazia-nos refeições,
00: 08: 11.25 mas depois trancou a porta novamente,
00: 08: 15.05 até que-e havia uma máquina de escrever –
00:08:16.13 até que nós produzimos um manuscrito de rascunho, o que fizemos.
00: 08: 20.06 mas havia uma pergunta Como escrever isto.
00: 08: 22.01 havia duas maneiras que discutimos.
00: 08: 24.,Uma maneira é começar com uma hipótese, a hipótese Watson-Crick,
00:08:28.25 e dizer aqui está um teste, nós fazemos este experimento.
00: 08: 31.26 e ver se funciona como eles disseram que deveria.
00:08:36.13 e esta é certamente uma maneira de fazer um experimento, e Richard Feynman, que era muito próximo dos estudantes naqueles dias
00:08:41.26 ele viria a nossas festas e assim por diante. Ele achou que devíamos escrever assim.
00: 08: 47.08 a outra maneira seria escrever exatamente o que sua experiência disse, não mais, não menos
00: 08: 53.,19 sem qualquer referência a quaisquer hipóteses,
00:08:56.00 e, em seguida, no final dizer se ele pode concordar com alguma hipótese.
00:09:00.15 escolhemos a última forma, em parte porque nós pensamos, bem, se você está tentando testar uma hipótese,
00:09:07.01 a única forma de realmente ter a certeza que você vai ser direito
00:09:10.03 é conhecer todas as possíveis hipóteses.
00: 09: 13.26 e já que ninguém pode saber todas as hipóteses possíveis
00:09:16.06 só porque sua experiência pode concordar com uma delas
00:09:18.29 não prova que essa é a hipótese certa.
00: 09: 21.,02There poderia ser outro que a sua experiência concorda com
00:09:24,20 em nos pareceu mais elegante para escrever o nosso papel
00:09:27.21 em termos de subunidades, e só no final dizer,
00:09:30.19″ah, essas subunidades pode ser o único cadeias de Watson-Crick modelo,”
00:09:35.13 que, naturalmente, eles foram. Então foi isso que fizemos.
00: 09: 37.22 e então este diagrama aqui mostra o resultado em termos de subunidades
00: 09: 42.10 não cadeias de DNA. O que fizemos foi abençoado por muitos acidentes.
00:09:48.11 o acidente de estar em Caltech,
00: 09: 50.,02O acidente de nos encontrarmos em Woods Hole, o acidente de ter Max Delbruck a impressioná-lo com o seu profundo pessimismo de que o ADN não poderia replicar o trabalho Watson e Crick da forma como funciona.
00: 10: 02.26 e finalmente o acidente de descobrir que a própria centrifugadora
00:10:06.16 fará um gradiente de densidade, você não tem que
00:10:09.06 fazer um pré-existente.
00: 10: 11.01 o efeito desta experiência vale a pena dizer algo sobre.
00: 10: 14.13 quando a estrutura do DNA foi proposta, um lote
00: 10: 16.,14 pessoas não acreditaram.
00: 10: 18.01 And there were not a lot of references to it in the literature.
00: 10: 20.18 para os primeiros anos após 1953.afinal de contas, foi baseado num edifício modelo, o que não prova nada.
00: 10: 27.23 parecia tão bonito que algumas pessoas estavam convencidas
00:10:31.04 que tinha que estar certo porque parecia tão certo.
00: 10: 34.19 outras pessoas eu acho que estavam convencidos de que não poderia estar certo porque parecia bom demais para ser verdade.de qualquer forma, era apenas um modelo.
00: 10: 44.,09A evidência da difração de raio-X não foi muito favorável.
00: 10: 48.22 ele mostrou que a distância repetida era uma certa distância
00:10:52.04 e que era helicoidal, mas você não poderia
00:10:54.14 deduzir qualquer um dos detalhes dessas primeiras fotos de raio-X.
00: 10: 58.02 I think the effect of our experiment was not really a discovery,
00: 11: 02.22 It was a psychological effect. Fez o ADN parecer real. De repente você poderia ver bandas em uma centrifugadora.que estavam se comportando da maneira que Watson e Crick disseram que deveriam.
00: 11: 14.,02E eu acho que o principal valor da experiência foi
00:11:18.04 que tinha o valor psicológico de convencer um monte de pessoas
00:11:21.18 que a estrutura de DNA tinha que estar certa.
00: 11: 24.29 deixe – me dizer algo sobre essa molécula.
00: 11: 27.20 esta molécula essencialmente deu ordens a um período inteiro no desenvolvimento da biologia molecular.
00: 11: 34.12 aqui está esta dupla hélice, ali parada,
00: 11: 36.16 e está dizendo, ” Aqui estou eu. Tenho duas correntes. Vai descobrir como me replicar.”
00:11:41.13 ” Here I am. Tenho quatro tipos de bases.”
00: 11: 44.,05 ” vá descobrir como isso é convertido em proteínas.”
00:11:47.26 ” I sit in the nucleus. As proteínas são feitas no citoplasma em eucariotas.”
00:11:52.21 ” Go figure out what it is that takes this information from me out to the cytoplasm.”
00:11:56.21 ” My information being up of these bases changes on a while.”
00:12:01.09 ” que se chama mutação. Vai descobrir como isso acontece.”
00: 12: 04.08 ” de vez em quando há algo chamado recombinação genética.”
00:12:08.10 ” vá descobrir como eu sou…”O que eu estou tentando dizer aqui
00:12:11.,16 é que se eu lhe mostrasse um modelo de, digamos, um polissacarídeo, poderia dizer-lhe que experiência deve fazer a seguir?
00:12:17.11 Desta molécula, o DNA, é como o feiticeiro de Oz
00:12:20.11 de pé (exceto ao contrário, o assistente, este é um verdadeiro molécula)
00:12:24.04 de pé e dizendo-lhe, essencialmente, toda a agenda
00:12:29.25 para o futuro da ciência para os próximos 20 anos.
00:12:32.07 agora que é um humor e atitude completamente diferente, eu acho,
00: 12: 37.03 da ciência que foi antes dele
00: 12: 39.15 e a ciência biológica que veio depois dele.,
00: 12: 42.25 de modo que foi Moeda desta época.
00: 12: 44.06 era a molécula de DNA dizendo a você quais eram os problemas, e o que você tinha que sair e resolver.