O teste de oxidase detecta a presença de um citocromo oxidase sistema que irá catalisar o transporte de elétrons e entre elétrons doadores na bactéria e um redox tintura – tetrametil-p-fenilenodiamina. O corante é reduzido a cor púrpura profunda., Este teste é utilizado para auxiliar na identificação de Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella e Pasteurella, todos os que produzem a enzima citocromo oxidase.

pode utilizar-se um certo número de reagentes para este ensaio.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Os organismos que contêm citocromo c como parte da sua cadeia respiratória são oxidase-positivos e tornam o Reagente Azul/Roxo. Organismos sem citocromo c como parte de sua cadeia respiratória não oxidam o reagente, deixando-o incolor dentro dos limites do teste, e são oxidase-negativo.as bactérias positivas Oxidase possuem citocromo oxidase ou indofenol oxidase (uma hemoproteína contendo ferro). Ambos catalizam o transporte de elétrons de compostos doadores (NADH) para aceitadores de elétrons (geralmente oxigênio)., O dicloridrato de n, N, n, n’, n’-tetrametil-p-fenilenodiamina actua como um aceitador artificial de electrões para a enzima oxidase. O reagente oxidado forma o composto colorido indofenol azul.o sistema citocromo está geralmente presente apenas em organismos aeróbicos que são capazes de utilizar oxigénio como receptor de hidrogénio final. O produto final deste metabolismo é água ou peróxido de hidrogénio (decomposto por catalase).o teste da oxidase é utilizado para determinar se um organismo possui a enzima citocromo oxidase.,o teste é utilizado como auxílio à diferenciação das espécies Neisseria, Moraxella, Campylobacter e Pasteurella (oxidase positive).é também usado para diferenciar pseudomonads de espécies relacionadas.

Procedimento do ensaio da Oxidase

Existem muitas variações do método do ensaio da oxidase. Estes incluem, entre outros, o ensaio em papel de filtro, o método da placa directa, o método do esfregaço, o método da tira oxidase impregnada e o método do tubo de ensaio. Todos os tempos e concentrações baseiam-se nas recomendações originais.,

Método do Papel Filtro Seco

Desde que o oxidase reagente é instável e tem de ser preparados para utilização, este método é conveniente.a tira do papel de filtro n. o 1 do Whatman é embebida numa solução de 1% de dicloridrato de tertrametil-p-fenilenodiamina preparada recentemente.após uma drenagem de cerca de 30 segundos, as tiras são liofilizadas e conservadas num frasco escuro bem selado com uma tampa de rosca.para uso, uma tira é removida, colocada numa placa de petri e humedecida com água destilada.,a Colónia a testar é recolhida com um laço de platina e espalhada sobre a área húmida.

uma reacção positiva é indicada por uma tonalidade deep-purple intensa, que aparece dentro de 5-10 segundos, uma reacção “positiva retardada” por coloração em 10-60 segundos, e uma reacção negativa por ausência de coloração ou por coloração mais de 60 segundos.

Wet Filter Paper Method

1. uma tira de papel de filtro é embebida com uma solução de 1% do reagente acabada de fazer.uma mancha de cultura é esfregada nela com um laço de platina.,
2. uma reacção positiva é indicada por uma tonalidade deep-purple intensa, que aparece dentro de 5-10 segundos, uma reacção “positiva retardada” por coloração em 10-60 segundos, e uma reacção negativa por ausência de coloração ou por coloração mais de 60 segundos.

método directo em placa

1. adicionar 2 -3 gotas de reagente directamente a colónias suspeitas numa placa de ágar. Não inundar a placa com reagente.Observe a mudança de cor em 10 segundos.Nota: O método directo em placa deve ser efectuado numa placa de ágar não selectiva.,quando se utiliza o reagente oxidase de Kovac, os microrganismos são oxidase positivos quando a cor muda para roxo escuro em 5 a 10 segundos. Microorganismos são retardados oxidase positivo quando a cor muda para roxo em 60 a 90 segundos. Os microrganismos são oxidase negativos se a cor não mudar ou se demorar mais de 2 minutos.quando se utiliza o reagente de Gordon e McLeod, os microrganismos são oxidase positivos quando a cor muda para vermelho em 10 a 30 minutos ou para preto em 60 minutos. Os microrganismos são oxidase negativos se a cor não mudar.,

método de esfregaço

1. mergulhe o esfregaço no reagente e depois toque numa colónia suspeita isolada
2. Observe uma mudança de cor dentro de 10 segundos.o método do tubo de ensaio

produz uma cultura fresca (18 a 24 horas) de bactérias em 4,5 ml de caldo nutriente (ou meio padrão que não contém uma elevada concentração de açúcar).Adicionar 0, 2 ml de 1% de α-naftol e Adicionar 0, 3 ml de 1% de oxalato de p-aminodimetilanilina (reagentes de Gaby e Hadley).agitar vigorosamente para assegurar a mistura e oxigenação completa da cultura.,

Observe as mudanças de cor.os microrganismos são oxidase positivos quando a cor muda para azul em 15 a 30 segundos. Os microrganismos são retardados oxidase positivos quando a cor muda para púrpura em 2 a 3 minutos. Os microrganismos são oxidase negativos se a cor não mudar.a interpretação do resultado do teste da Oxidase

resultado positivo

desenvolvimento de uma cor púrpura profunda azul/azul indica produção de oxidase em 5-10 segundos.

resultado negativo

Sem cor púrpura azul / sem alteração de cor.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Controle de Qualidade para Teste de Oxidase

Controlo Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Controlo Negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Limitações do Teste de Oxidase

1. Os reagentes usados no teste de oxidase foram mostrados para auto-oxidar, por isso, é muito importante o uso de reagentes frescos, de não mais de 1 semana.tanto as bactérias como as leveduras cultivadas em suportes contendo elevadas concentrações de glucose mostram uma actividade oxidase inibida, pelo que se recomenda testar as colónias cultivadas em suportes sem excesso de açúcar, tais como o ágar nutriente., A agar de soja triptica é também uma excelente mídia.as bactérias cultivadas em meios contendo corantes podem dar resultados aberrantes.os reagentes de ensaio matarão eficazmente os microrganismos, pelo que a sub-cultura deve ser feita antes de adicionar qualquer reagente a uma cultura activa.o teste da oxidase pode ser utilizado na identificação presumível de Neisseria e na diferenciação e identificação de bacilos gram-negativos. Os organismos Oxidase-positivos devem ser examinados por coloração gram para determinar a morfologia e a reacção gram., São recomendados testes bioquímicos adicionais para a identificação completa.
2. o uso de um nicromo ou outro ciclo contendo ferro pode produzir reações falsas-positivas. Loops de platina são recomendados.a maioria do Haemophilus é oxidase-positivo. As tiras ou reagentes menos sensíveis podem produzir resultados falsos negativos.as reacções Oxidase de bacilos gram-negativos devem ser determinadas em meios não selectivos e não diferenciais, de modo a garantir resultados válidos. Além disso, as colónias obtidas a partir de meios que contêm níveis elevados de glucose podem provocar reacções falsas-negativas.,recomenda-se a utilização de Colónias com 18 a 24 horas de idade. Colónias mais antigas irão produzir reacções mais fracas.não devem ser tidas em conta quaisquer alterações de cor que ocorram após 20 segundos.