Next generation sequencing (NGS) methods started to appear in the literature in the mid-2000s and had a transformative effect on our understanding of microbial genomics and infectious diseases. No entanto, há uma controvérsia considerável sobre como, quando e onde a sequenciação da próxima geração irá desempenhar um papel no laboratório de diagnóstico clínico., A Deep dive point-counterpoint discussion from the Journal of Clinical Microbiology discusses the challenges and opportunities that may come with introduction of metagenomic next generation sequencing (mNGS) into routine laboratories. O que exatamente é mNGS e como é diferente de muitas outras tecnologias de ácido nucleico lá fora?o que é a sequenciação Metagenómica da próxima geração?sequenciamento de próxima geração é qualquer um dos vários métodos de sequenciamento de alto rendimento em que bilhões de fragmentos de ácido nucleico podem ser simultaneamente e independentemente sequenciados., Contrasta esta técnica com métodos clássicos como sequenciamento de Sanger (também conhecido como sequenciamento de terminação de cadeia de dideoxinucleótidos), que processa uma sequência de nucleótidos por reação. para caracterizar um genoma bacteriano usando NGS, por exemplo, o genoma é dividido em múltiplos fragmentos que produzem sequências ou leituras que variam de centenas a dezenas de milhares de bases em comprimento. As sequências são reunidas em um único genoma usando abordagens computacionais. Várias leituras de sequência sobrepostas são reunidas para produzir uma única sequência mais longa chamada contig., Existem muitas vezes lacunas entre contigs e embora a leitura de sequência mais longa de alta fidelidade seria o método ideal de sequenciação, plataformas que produzem leituras mais curtas são geralmente menos dispendiosas e a sobreposição em sequências torna-os mais precisos. O genoma construído (provavelmente contendo lacunas) está alinhado com uma base de dados de referência para a identificação do organismo. Esta tecnologia representa um avanço substancial nos primeiros dias da sequenciação, quando um único projeto de genoma bacteriano pode levar vários anos., NGS Metagenômicas (mNGS) é simplesmente executando todos os ácidos nucleicos em uma amostra, que pode conter populações mistas de microrganismos, e atribuindo-os a seus genomas de referência para entender quais micróbios estão presentes e em que proporções. A capacidade de sequenciar e identificar ácidos nucleicos de vários taxa diferentes para análise metagenômica faz com que esta seja uma nova plataforma poderosa que pode identificar simultaneamente material genético de reinos inteiramente diferentes de organismos.,as possíveis aplicações clínicas são tremendas, incluindo diagnóstico de doenças infecciosas, rastreamento de surtos, vigilância de controle de infecções, e descoberta de mutações e patógenos, entre muitos outros. mNGS, às vezes chamado sequenciamento de caçadeira, de amostras clínicas tem sido aplicada a vários tipos de amostras, incluindo líquido cefalorraquidiano, sangue, amostras respiratórias, fluido gastrointestinal, e fluido ocular.

quais são os benefícios da sequenciação da próxima geração Metagenómica?,

the largest strength of mNGS is that it is an unbiased hypothesis-free diagnostic method, unlike targeted polymerase chain reaction (PCR) methods that rely on primers for identification of specific targets to be amplified and detected. Mesmo universal, ou ampla gama de métodos de PCR não são suficientemente amplo para ser considerado metagenomic, como eles utilizam primers específicos conservados 16S RNA ribossómico (rRNA) gene e espaçadores internos transcritos (ITS) para amplificar seqüências distintas de sequências de ácidos nucleicos que pode ser bioinformatically classificados em bactérias/archaea, ou fungos, respectivamente., os primários universais também representam um problema quando diagnosticam infecções polimicrobianas com testes moleculares. Se as populações polimicrobiais estiverem presentes ao usar sequenciamento 16S, múltiplas chamadas de base serão feitas por nucleótido, produzindo um cromatograma de nucleótido misto que não pode ser interpretado. Embora existam métodos computacionais des-convolucionais disponíveis para prever organismos identificados, estes não estão em uso padrão para muitos laboratórios, que muitas vezes refletem a sequenciação da próxima geração do gene 16S para amostras polimicrobiais., quais são os desafios da sequenciação da próxima geração metagenômica?

apesar do potencial do mNGS, existem muitas barreiras para limpar antes que a tecnologia possa se tornar parte do laboratório mainstream, bem como lacunas em nossa compreensão sobre sua utilidade de diagnóstico. As principais reservas incluem a interpretação de descobertas (distinguindo contaminação e colonização de patógenos verdadeiros), seleção e validação de bases de dados utilizadas para análises e previsão (ou falta dela) de susceptibilidades antimicrobianas., Uma percepção comum é que mNGS é tão incrivelmente sensível que vai revelar um diagnóstico quando todos os outros testes são negativos. Enquanto mNGS pode ser analiticamente mais sensível do que o padrão de métodos de cultivo, em alguns casos, necessária a remoção de grandes quantidades de humanos ácido nucleico durante a seqüência de preparação e (por métodos computacionais), durante o pós-processo analítico, pode diminuir a sensibilidade em comparação ao alvo PCR abordagens para muitos organismos. a especificidade do mNGS permanece o proverbial elefante na sala., A contaminação das amostras durante a colheita de amostras constitui uma grande preocupação, dado o aumento da sensibilidade analítica das mNGS em comparação com os métodos de cultura padrão, e é necessário que exista um processo de controlo de qualidade validado para as etapas que vão desde a avaliação da pureza do reagente até à medição dos controlos adequados da cobertura do genoma. Além disso, com algumas plataformas de iluminação, os índices de código de barras errados podem ser designados, levando a falsos positivos em dados de sequenciação., São necessários controlos de qualidade bioinformáticos para garantir que os genomas de alta qualidade e validados estão disponíveis com erros mínimos na base de dados e que, idealmente, haveria pessoal bioinformático disponível para interpretar os resultados de sequenciação para cada teste, que não está disponível na maioria dos laboratórios microbiológicos clínicos., A Federal Drug Administration (FDA) colaborou com outras agências federais para criar um banco de dados intitulado FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), que tem sido útil para garantir que os resultados atuais da mNGS são confiáveis e precisos, mas esses recursos precisam ser atualizados e mantidos. the greater question remains surrounding the clinical specificity of mNGS: Are the detected sequences from pathogenesis that are contributing to the patient’s current disease?, A especificidade analítica do mNGS testes podem ser tratadas com rigorosos controles durante a coleta de amostra, o sequenciamento de biblioteca de preparação, ensaio executado, e bioinformatic classificação, mas a especificidade clínica não é dirigida diretamente por essas abordagens. Perguntas que podem ajudar a determinar a utilidade clínica e aplicabilidade incluem: como podemos distinguir organismos relacionados com bacteremia transitória de flora oral/gastrointestinal ou colonizadores de pele no sangue/plasma mNGS teste?, Como deve ser relatada a profundidade de sequenciamento e quão confiável é a relação de profundidade de sequência com a verdadeira infecção? Esta relação difere por agente patogénico / hospedeiro? Quanto tempo é a semi-vida detectável esperada de um agente patogénico pela mNGS quando o doente está a receber uma terapêutica curativa apropriada? Estudos sobre utilidade clínica e relação custo-eficácia são muito necessários, apesar do poder indiscutível desta tecnologia a partir de uma perspectiva de pesquisa e descoberta., também vale a pena ressaltar que não existem atualmente testes mNGS limpos ou aprovados pela FDA que podem ser enviados para testes microbianos, embora existam laboratórios certificados sob as alterações de melhoria laboratorial Clínica de 1988 (CLIA ’88) que oferecem testes em amostras clínicas. Até à data, apenas alguns sistemas de diagnóstico NGS foram limpos pela FDA para testes oncológicos ou detecção de fibrose cística, por exemplo., Uma revisão recente descreve em detalhes muitos dos obstáculos regulamentares e considerações que precisam ser solucionados antes de mNGS poderia entrar no mainstream clínicos, de diagnóstico, laboratórios de FDA de ensaio validados.
Em resumo, enquanto mNGS testes, provavelmente, pode desempenhar um papel importante no diagnóstico microbiológico de fluxo de trabalho no futuro, particularmente como sequenciamento e bioinformatic poder de processamento evolui, este é um de alta-complexidade da tecnologia para que a utilidade clínica na nossa prática médica atual ambiente permanece incerto., Embora o teste de mNGS possa oferecer novas e excitantes oportunidades clínicas de diagnóstico em um futuro próximo, nenhuma delas provavelmente irá substituir um médico astuto em breve.