Depois de ter estudado na RADA de 1992 a 1995, Macfadyen tornou-se conhecido no teatro Britânico principalmente por seu trabalho com o estágio de empresa Cheek by Jowl, para que ele jogou Antonio Da Duquesa de Malfi, Charles Superfície na Escola de Escândalo, e Benedick em Muito barulho por Nada. Seu Benedick foi interpretado como um palhaço da classe oficial com um bigode e uma gargalhada. Em 2005, ele interpretou o Príncipe Hal em Henrique IV, partes um e dois no Royal National Theatre, com Michael Gambon no papel de Falstaff., Em 2007, ele voltou ao palco, retratando um americano, Clay, um pai hospedado em casa com uma atitude liberal na peça the Pain and The Itch.um avanço na TV veio quando ele apareceu como Hareton Earnshaw em uma adaptação de Wuthering Heights, exibido na rede ITV em 1998. Outros trabalhos de drama de televisão se seguiram, incluindo papéis de protagonista nos dramas Warriors (1999) e The Way We Live Now (2001), ambos para a BBC. Também em 2001, ele ganhou aclamação por seu papel principal na série de drama da BBC Two Perfect Strangers, que foi escrito e dirigido por Stephen Poliakoff., Em 2002, ele estrelou o projeto, um drama da BBC charting New Labour’s rise to power. Ele estrelou em Spooks, que se tornou um sucesso quando exibido na BBC One. Uma segunda temporada mais longa foi exibida em 2003, e uma terceira temporada foi transmitida no outono de 2004, com ele deixando a série no segundo episódio. A série foi ao ar como MI-5 na rede a &e. Em 2007, ele apareceu no drama Secret Life do Channel 4, que lidou com o tema controverso da pedofilia., Macfadyen ganhou o prêmio de Melhor Ator no Royal Television Society 2007 Awards por esta parte, e foi nomeado para um BAFTA. Ele também apareceu em um pequeno esboço para Comic Relief como noivo no casamento de Mr.Bean, ao lado de Rowan Atkinson e Michelle Ryan.
Busto de Mr. Darcy interpretado por Matthew Macfadyen no Orgulho & Preconceito (filme de 2005)
Macfadyen apareceu em filmes, incluindo Enigma (lançado em 2001), e No de Meu Pai Den, para que ele recebeu a Nova Zelândia Ecrã Prêmio de Melhor Ator., Ele estrelou como o protagonista Romântico Fitzwilliam Darcy em uma adaptação de Pride and Prejudice, lançado no Reino Unido em setembro de 2005.Macfadyen estrelou a morte de Frank Oz em um Funeral e o filme incendiário, baseado no romance de Chris Cleave ao lado de Michelle Williams e Ewan McGregor. Ele também apareceu no filme de Ron Howard Frost/Nixon, no qual interpretou John Birt. Em 2008, ele interpretou o protagonista masculino Arthur Clennam na adaptação da BBC do pequeno Dorrit de Charles Dickens., Em 2009, Macfadyen apareceu ao lado da atriz indicada ao Oscar Helena Bonham Carter no filme Enid da BBC Four, baseado na vida de Enid Blyton, como Hugh Pollock, editor de Blyton e primeiro marido.em 2010, ele interpretou o xerife de Nottingham em Robin Hood. Ele estrelou como Prior Philip na série de TV The Pillars of the Earth, e foi o Logan Mountstuart de meia-idade em qualquer coração humano. Em junho de 2010, Macfadyen ganhou o British Academy Television Award de Melhor Ator Coadjuvante por seu trabalho em Justiça Criminal.,em 2011, Macfadyen fez uma última participação no programa da BBC Spooks, e em 2012, ele interpretou Oblonsky no filme de Joe Wright, Anna Karenina. Em dezembro de 2012, ele começou a interpretar o detetive inspetor Edmund Reid na BBC One’s Ripper Street.
em 2013-14 ele interpretou Jeeves na produção de Jeeves e Wooster em perfeito disparate no Teatro Duque de York no West End de Londres. A peça ganhou o Prêmio Olivier de Melhor Comédia Nova de 2014.
em 2015 a Amazon Prime pegou Ripper Street e, após boas críticas, foi reiniciado para a quarta e quinta temporadas., Macfadyen disse que estava “encantado por embarcar em outra dose de Estripador Street – sangue e tripas, Relógios de bolso e chapéus vitorianos, maravilhosamente escuro, comovente e linhas misteriosas da história de Richard Wardlow”. A série também foi ao ar nos EUA na BBC America. Também em 2015, ele estrelou o episódio piloto do último reino.ele atualmente interpreta Tom Wambsgans na sucessão da série HBO, pelo qual recebeu uma nomeação ao Primetime Emmy Award.,em 2020, ele apareceu no papel do Major Charles Ingram em um drama de três partes da ITV, Quiz, baseado no controverso escândalo tossing cheat em quem quer ser milionário em 2001.