Design de síntese de acetil-CoA caminho
A maneira mais simples de sintetizar carbono orgânico de um-carbono é construir um por um., Para construir uma via acetil-CoA artificial a partir de um carbono, propusemos a via Acetil-CoA sintética (SACA), onde duas moléculas de formaldeído seriam transferidas para uma molécula de acetil-CoA através de apenas três etapas (Fig. 1a). Em primeiro lugar, o formaldeído seria condensado em glicolaldeído (GALD) pela glicolaldeído sintase (GALS). E então o glicolaldeído seria convertido em acetil-fosfato (AcP) pela acetil-fosfato sintase (ACPS) usando fosfato inorgânico. Por último, a AcP seria utilizada para produzir acetil-CoA pela enzima conhecida fosfato acetiltransferase (PTA)25., Entretanto, o formaldeído pode ser obtido através da redução do dióxido de carbono e do formate26 ou da oxidação do metano e do metanol27. Assim, poderíamos realizar a biossíntese do acetil-CoA do formaldeído e até de outros recursos de carbono.
descrição e análise computacional da via SACA. a via SACA foi destacada no painel vermelho. A principal matéria-prima do formaldeído pode ser o metanol, o formato e até o metano e o CO2., O produto do acetil-CoA pode ser usado para gerar os principais nutrientes celulares. b os dados termodinâmicos de três vias desenhadas para a síntese acetil-CoA foram gerados pelo sítio web do equilibrador (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG sou: o total de Gibbs mudança de energia; Etapas: o número de reações a partir de formaldeído a acetil-CoA no estudou vias; MDF: o máximo de força motriz; Rendimento: o rendimento total das emissões de carbono, estudou vias; Coenzimas: o número de coenzimas é usado no estudou caminhos
A termodinâmica pode-se refletir se um caminho que poderia ser efetivamente realizadas in vivo ou in vitro. Calculámos a força motriz química termodinâmica da via SACA projectada., A reação global de formaldeído a acetil-CoA é altamente termodinamicamente favorável, onde a mudança total de energia de Gibbs (Δrg’s) de toda a reação é cerca de -96,7 kJ mol−1 (Fig. 1b e quadro Complementar 1). O valor de MDF (força motriz máxima) é geralmente usado para avaliar a qualidade termodinâmica e cinética de diferentes pathways28. Se o MDF for suficientemente elevado, a via não contém estrangulamentos termodinâmicos que possam dificultar o seu funcionamento in vivo. A via SACA obteve o valor MDF relativamente elevado de 26.,9 kJ mol−1, que é obviamente superior às vias FLS e MCC (os seus valores MDF são 1,9 e 5,8 kJ mol−1, respectivamente). Portanto, a via SACA é termodinamicamente favorável para a biossíntese do acetil-CoA do formaldeído.
identificação de uma nova enzima de C1 A C2
a condensação de formaldeído pode ser catalizada pela carabina n-heterocíclico em chemistry29,30. Em Biologia, O anel tiazólio do cofactor difosfato de tiamina (ThDP) tem função similar, que pode ativar um aldeído e então formar dímero com outro aldeído31., A fim de encontrar uma enzima para condensar duas moléculas de formaldeído em uma molécula de glycolaldehyde, nós referidos mecanismos catalytic de ThDP dependente de enzimas e construído um theozyme modelo, que inclui ThDP, glycolaldehyde, e ácido glutâmico, que fornece elétrons para o reaction32 (Fig. 2a). Todas as enzimas do Protein Data Bank (PDB) foram virtualmente rastreadas com base no modelo theozyme e foram atingidas 37 estruturas proteicas não redundantes com thdp ligand (Fig suplementar. 1 e Nota complementar)., De acordo com os mecanismos catalíticos de thdp-dependente enzymes33,34,35, C2 atom in ThDP é o centro ativo. A distância entre o átomo C2 e o produto do glicolaldeído é fundamental para desencadear a reação catalítica (Fig. 2a). Assim, analisamos a distância entre o átomo C2 e o glicolaldeído em cada proteína candidata.
theozyme model construction and functional identification of the glycolaldeído synthase., a theozyme model interaction between glycolaldeído and the active centers of different ThDP-dependent enzymes. O glutamato (glu) é tan; glicolaldeído é ciano; ThDP é verde. As distâncias entre o átomo C2 em TDP e os átomos de carbono de glicolaldeído são representadas por d1 e d2. O ponto verde é íon de magnésio. b as distâncias médias (azul) entre d1 e d2 em cada proteína são mostradas à esquerda. A quantidade de produto (amarelo) para a proteína testada é mostrada à direita. A reacção foi efectuada adicionando 1 mg de mL−1 das proteínas testadas e 2 g de formaldeído L−1. Não há detecção., As barras de erro representam S. D.( desvio-padrão), n = 3. c expressão proteica de três candidatos funcionais utilizando 1 mL de uma célula de uma. M: marcador de proteína; 1, 3 e 5 representam a expressão da proteína sem IPTG para 2UZ1, 3FZN, e 4K9Q, respectivamente; 2, 4, e 6 representam a expressão da proteína em IPTG indução para 2UZ1, 3FZN, e 4K9Q, respectivamente; As setas vermelhas apontam para a proteína bandas para 2UZ1, 3FZN, e 4K9Q, respectivamente. Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.,
com Base na média das distâncias de cada proteína usando molecular de ancoragem (Dados Suplementares 1)36, seis candidatos com distâncias curtas e claras funcional anotações foram definidos como candidatos (Fig. Quadro 2). Além disso, três proteínas com longas distâncias foram escolhidas aleatoriamente como controles. Os candidatos e os controlos foram expressos e purificados para testar a sua capacidade de produzir glicolaldeído a partir de formaldeído., Três dos seis candidatos exibiram a atividade desejada, enquanto três controles não tinham a função, indicando a distância entre o átomo C2 e o glicolaldeído desempenha um papel crítico na condensação do formaldeído. Entre os três candidatos ativos, a proteína 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) que foi denominado benzaldeído liase (BAL), foi relatado preferencialmente gerar dihidroxiacetona (DHA), apesar de o mínimo de rendimento de glycolaldehyde quando a concentração de formaldeído foi lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
evolução dirigida da glicolaldeído sintase
Uma vez que BAL tinha sido concebido para produzir DHA a partir de formaldehyde22, propusemos detectar se as mutações correspondentes na BFD também contribuiriam para melhorar a actividade enzimática (Fig. 2). Através do rastreio de todos os resíduos mutantes, encontramos de facto uma mutação altamente activa W86R-N87T que se situava no canal substrato da BFD (Fig suplementar. 3). Assim, esta mutação (W86R-N87T) foi introduzida em BFD e a variante foi marcada como M1., A fim de melhorar ainda mais a atividade catalítica do BFD, propusemos rastrear todos os resíduos em torno do centro ativo do BFD, onde 25 posições dentro de 8 Å distância do centro ativo foram selecionados para fazer mutagênese de saturação de um único ponto (Fig. suplementar. 4). Desenvolvemos uma abordagem de triagem de alta capacidade para detectar glicolaldeído por reação de cor entre glicolaldeído e difenilamina, que foi medida por monitor espectrofotometricamente a 650 nm (Figo suplementar. 5)., Após a triagem, descobrimos que 14 de 25 posições mostraram atividades mais elevadas do que M1 mutante (Fig. suplementar. 6). Posteriormente, 14 posições foram divididos em 8 grupos: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), e H (T379/T380). O N27 foi usado três vezes desde que as variantes nesta posição exibiam a maior atividade. Usando M1 como modelo, introduzimos cada grupo de mutações em M1 e selecionamos o mutante ativo mais alto, que foi rotulado como M2., Ao realizar três rodadas de mutagénese combinatória iterativa entre estas posições, nós rastreamos totalmente 64.512 clones e obtivemos um mutante de alta atividade que contém cinco novas mutações em torno do centro ativo. Finalmente, a variante com 7 mutações de resíduos foi nomeada como glicolaldeído sintase (GALS). O kcat das GALS foi melhorado cerca de 160 vezes e a eficiência catalítica final das galas é de 9,6 M-1 * s-1, que é aproximadamente 70 vezes maior que a enzima inicial (Fig. 3a e Fig. suplementar. 7).
Engenharia proteica e análise do mecanismo da glicolaldeído sintase. parâmetros cinéticos de WT e mutantes. WT: tipo selvagem; M1: mutações na W86R e N87T; M2: mutações na W86R, N87T, L109G, e L110E; M3: mutações na W86R, N87T, L109G, L110E e A460M; M4: mutações na W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V, e Q282F. b visão geral dos selecionados cinco mutações no centro ativo. IMA: análogo intermédio; as linhas laranja indicam as ligações de hidrogénio entre o grupo hidroxilo da IMA e a mutação L110E., c os volumes de bolso de M1, M2, M3 e M4. Os pontos rosa representam os volumes dos binding-pockets (dados suplementares 2), que são 131.25, 161.50, 133.38 e 171.38 Å3, respectivamente. As figuras foram renderizadas usando UCSF Chimera software versão 1.1246. Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.
a fim de descobrir como estas mutações melhoram a actividade enzimática, propusemos redecorar a cristalização de GALS. O pocket ativo localiza-se na interface do homodímero de GALS38., A estrutura proteica das galas pode diferir da proteína inicial após várias fases de mutação. Aqui, cristalizamos a proteína das galas e recuperamos a estrutura cristalina das galas usando a estrutura de BFD como o modelo de busca (tabela suplementar 3). A estrutura cristalina das galas foi analisada (Figo suplementar. 8, Suplemento Fig. 9). Descobrimos que a mutação do L110E introduz duas ligações de hidrogénio adicionais ao grupo hidroxilo do análogo intermédio (IMA), que podem contribuir para estabilizar o estado de transição e clivagem da ligação C–C entre o produto e o cofactor ThDP (Fig. 3b)., A mutação de L109G ampliou o volume de Bolsa de ligação do substrato, substituindo o grande grupo isobutilo por um grupo de hidrogénio. A terceira mutação de A460M pode reorientar o substrato e, em seguida, aumentar a interação entre ThDP e substrato. As duas últimas mutações H281V e Q282F expandiram o raio dos poros da superfície exterior e podem facilitar o acesso ao substrato ou produto(Fig. 3c). Comparando com M1, o volume de Bolsa de reação em GALS foi aumentado mais de 30%, o que seria a principal razão para a melhoria da atividade catalítica.,
identificação da acetil-fosfato sintase
na natureza, nenhuma enzima foi notificada para atingir a síntese de AcP a partir de glicolaldeído. As fosfoketolases (PKs) podem produzir AcP a partir de frutose-6-fosfato (F6P) ou xilulose-5-fosfato (X5P)39. De acordo com o mecanismo catalítico de PKs, é possível que o glicolaldeído interage com ThDP e então gera 2-α,β-dihidroxietilideno-ThDP (Dhetdp) (Fig. 4a), que é o principal intermediário da formação AcP a partir de F6P ou X5P por PKs. Para confirmar nossa hipótese, selecionamos oito candidatos (Fig., 4B) based on the phylogenetic tree of PKs from 111 bacteria families (Supplementary Fig. 10). Após síntese genética e purificação de proteínas (Figo suplementar. 11), examinamos a atividade catalítica de todas as proteínas candidatas usando glicolaldeído como substrato. Felizmente, Cinco em cada oito PKs apresentavam actividades catalíticas significativas. Apenas PK1, PK4 e PK8 não mostraram diferença significativa em relação ao controle em branco. Assim, o PK2 com a maior atividade foi denominado como acetil-fosfato sintase (ACPS), cujo kcat/Km atinge 3,21 M−1·s−1 (Figo suplementar. 12).,
análise Computacional e funcional identificação da acetil-fosfato sintase. a formação de DHEThDP a partir de F6P / X5P e glicolaldeído. As setas sólidas representam o mecanismo de formação de DHEThDP em ref. 39; as setas tracejadas indicam o processo previsto usando glicolaldeído como substrato. b a identificação dos ACP. A árvore filogenética de máxima probabilidade dos oito PKs selecionados foi construída por MEGA47., Os detalhes do PKs selecionado estão presentes na nota suplementar e na figura suplementar. 10. A actividade de cada proteína foi detectada adicionando 0, 5 mg de enzima mL−1 e 10 mM de glicolaldeído. AcP acetil-fosfato, PK phosphoketolase, a Produção de AcP (µmol min−1 mg−1): a quantidade de AcP produzido por mg de enzima por minuto; Controle: sem enzima foi adicionado na reação do sistema; as barras de Erro representam s.d. (desvio padrão), n = 3. c o perfil de energia para o processo de formação de DHEThDP., O IM1 e o IM2 representam o intermediário 1 e 2 durante o processo de formação; o TIM representa o intermediário tautomerizado entre o IM1 e o IM2; o TS1 e o TS2 representam os estados de transição. Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.
para revelar o mecanismo de formação de DHEThDP a partir de glicolaldeído, propusemos realizar análises teóricas baseadas no modelo computacional anterior de PK40. Todos os possíveis aminoácidos relacionados com a formação de DHEThDP foram usados para construir o modelo computacional (figura suplementar. 13)., Com base na simulação computacional, descobrimos que a barreira de energia é apenas 11.36 kcal mol−1 para a formação de IM1 (intermédio 1) quando glycolaldehyde foi protonated por His553, o que foi considerado como o mais possível de prótons donor40 (Fig. 4c). Em seguida, IM1 tautomeriza em IM2 com a ajuda de Glu479 e Glu437. IM2 é energeticamente mais estável que IM1. Quando o próton de IM2 foi retirado por N4′ em ThDP,a barreira de energia de IM2 para o dhethdp intermediário chave é de 15.,13 kcal mol-1, que é tão semelhante à energia da estirpe durante a formação de DHEThDP utilizando F6P como substrate40. Após a formação de DHEThDP, os seguintes processos catalíticos são os mesmos que outros PKs (Fig suplementar. 14), i.é., H97 atua como doador de prótons do processo de desidratação de DHEThDP, e His142 e Gly155 acelerar o processo de desidratação de DHEThDP, a julgar pelo fato de que His142 e Gly155 formar pontes de hidrogênio com a molécula de água na estrutura do programa de pós-desidratação intermediário (AcThDP)., His64, Tyr501, and Asn549 are important for the nucleophilic attack by Pi and they together form The binding site of Pi39. As experiências de mutagénese no local indicaram também que estes resíduos são fundamentais para a actividade enzimática (Figo suplementar. 15).
síntese de acetil-CoA a partir de formaldeído in vitro
com o projecto inicial bem sucedido de GÁLEAS e de GASPES, pretendemos construir a via SACA in vitro para sintetizar acetil-CoA a partir de formaldeído. Em primeiro lugar, medimos o rendimento de glicolaldeído por GAIS sob diferentes concentrações de formaldeído., Os resultados mostraram que as GAROTAS podem efetivamente provocar a dimerização de formaldeído, e o rendimento de glycolaldehyde aumentou com a concentração de substrato melhoria (Fig. 5a). Por exemplo, o rendimento de glicolaldeído a partir de formaldeído aumentou de 45% a 0,5 g L−1 a 80% a 2 g L−1. Em segundo lugar, analisámos a eficiência catalítica do glicolaldeído para os países AcP, que foi quantificada pelo teor de ácido acético, uma vez que os países AcP seriam rapidamente degradados em ácido acético (Figo suplementar. 16)23., Os resultados mostraram que o rendimento dos AcP atingiu mais de 80% em diferentes concentrações de glicolaldeído através de ácido acetilsalicílico (Figo suplementar. 17). Infelizmente, os ACPS foram obviamente inibidos pelo formaldeído(Fig. 5b). Assim, é necessário ter um equilíbrio para a concentração de formaldeído na resolução deste conflito.
confirmando a biossíntese do acetil-CoA do formaldeído pela via SACA in vitro. a síntese de glicolaldeído de formaldeído por GAIS., As reacções foram executadas sob diferentes concentrações de formaldeído, com 2 mg mL−1 GALS purificadas a 37 °C durante 2 horas B. A Inibição do ácido acetilsalicílico por formaldeído. Os teores de ácido acético foram medidos em diferentes pontos temporais com tampão de reacção, 2 mg mL−1 ACP, 0,75 g de glicolaldeído L−1 e o gradiente de formaldeído de 0 a 2 g L−1, que foi representado por diferentes linhas de cores. c Rendimento do ácido acético a partir de diferentes concentrações de formaldeído. Foram efectuadas reacções a 37 °C durante a noite com tampão de reacção, 2 mg mL−1 GALS, 2 mg mL−1 ACPS e o gradiente de formaldeído a partir de 0.,5 a 2 g L-1. d teor de ácido acético ou acetil-CoA de 1 g de formaldeído L−1. Os teores de ácido acético ou acetil-CoA foram medidos em diferentes pontos temporais. A linha azul representa a reação do sistema para produzir acetil-CoA (com 20 mM de CoA de alimentação contendo 2 mg mL−1 do purificada GALS, ACP, e PTA, respectivamente); a linha laranja representa a reação do sistema para produzir ácido acético (contendo 2 mg mL−1 GALS e países ACP e sem CoA alimentação). As amostras em todos os ensaios foram analisadas pela HPLC. As barras de erro representam S. D.( desvio-padrão), n = 3., Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.
a fim de otimizar a concentração de formaldeído, foi realizado um experimento de gradiente usando o sistema de reação que contém 2 mg mL−1 de GAIS e ACPS. Com o aumento da concentração de formaldeído, o rendimento do ácido acético no sistema inicialmente aumentou e, em seguida, diminuiu (Fig. 5c). Quando a concentração de formaldeído é de 1 g L-1, o rendimento do ácido acético atingiu 50,6%., Curiosamente, o rendimento final do ácido acético é ainda maior do que o do sistema de reação de glicolaldeído para AcP com a mesma quantidade de formaldeído (Fig. 5b, linha cinzenta). Isso seria causado por liberar parcialmente a função de ACPS, uma vez que o formaldeído foi gradualmente consumido pelas galas. Com base neste sistema, acrescentámos ainda outro fosfato enzimático conhecido acetiltransferase (PTA), que converteria AcP em acetil-CoA. Por último, a via SACA produziu 5, 5 mM de acetil-CoA na concentração de formaldeído de 1 g L−1. O rendimento de acetil-CoA do formaldeído foi de cerca de 33% (Fig. 5d)., No entanto, o rendimento do ácido acético (7,8 mM) de formaldeído (33,3 mM) atingiu 50% se não fossem fornecidos PTA e CoA. O menor rendimento de acetil-CoA do que o do ácido acético seria causado pela instabilidade do acetil-CoA e AcP. Nossos resultados indicaram que é bem sucedido para a biossíntese do acetil-CoA do formaldeído pela via SACA in vitro.,Validation of the SACA pathway by 13C-labeling
After determining the SACA pathway with purified enzymes in vitro, we further trughted to test the biosynthesis of acetyl-CoA and it’s derivates from the SACA pathway in vivo by 13C-metabolic tracer assays (Fig. 6a). Em primeiro lugar, os lisatos celulares foram usados para verificar a biossíntese do acetil-CoA pela adição de formaldeído 13C e CoA. Detectámos um aumento significativo do duplo acetil-CoA marcado com 13C do que outros controlos (valor P < 0, 001, teste T) (Fig. 6B e Figo suplementar. 18)., Além disso, o aumento de acetil-CoA dupla de 13C desapareceu se omitirmos um dos genes na Via SACA, tais como ACPS e PTA (Figo suplementar. 19). Além disso, o acetil-CoA seria convergido com oxaloacetato para entrar no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Nós também detectado significativamente mais do dobro 13C-rotulado fumarato (P-valor < 0.001, teste-T) e malato (P-valor < 0.001, T test) somente na tensão com o por saca caminho e 13C-rotulado de formaldeído de alimentação (Fig. 6B e Figo suplementar. 18)., No entanto, não detectamos diferenças significativas nos isotopômeros de massa de ordem superior. Ele seria causado pela baixa quantidade de isotopômeros duplos marcados com 13C no ciclo TCA.
13C-etiqueted metabolic tracer analysis of the SACA pathway. um diagrama esquemático da via testada para o marcador marcado com 13C. b a fracção de compostos m + 2 em lisatos celulares com formaldeído marcado com 13C ou não marcado. c a fracção de metabolitos marcados com 13C., As células foram induzidas em LB e transferidas para o meio M9 contendo metanol marcado com 13C. Foram detectados metabolitos intracelulares após incubação de 16 h E foram medidos aminoácidos proteinogénicos após incubação de 26 h. A soma dos isotopômeros detectados foi definida como 100%., 13C-FALD 13C-rotulado de formaldeído, m + 0, sem 13C rotulagem, m + 1 único 13C rotulagem, m + 2 cama de 13C de rotulagem, FALD formaldeído, MeOH-metanol, GALD glycolaldehyde, AcP acetil-fosfato, Asp aspartato, Glu glutamato, PEP phosphoenolpyruvate, por saca o esforço contém o vetor GALS-ACP-PTA-28-a, 28-a, a tensão contém o vector vazio da 28a, BsMDH-por saca o esforço contém BsMDH-pCDF e GALS-ACP-PTA-28a vetores, BsMDH-28a: a tensão contém BsMDH-pCDF vetor e o vetor vazio 28a. As barras de erro representam s.d. (desvio padrão), n = 3., Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.
subsequentemente, propusemos testar o fluxo de carbono dentro das células. Devido à toxicidade do formaldeído para as células, introduzimos o metanol desidrogenase a partir de Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 para manter uma concentração continuamente baixa de formaldeído in vivo (Fig. 6a). As células cultivadas foram colhidas em diferentes pontos temporais e foram utilizadas para detectar aminoácidos proteinogénicos e metabolitos intracelulares (Fig. 6c)., Descobrimos que a estirpe com a via SACA (BsMDH-SACA) continha mais aspartato e glutamato com marcação dupla de 13C, que derivava do ciclo TCA. Além disso, a glucose e o fosfoenolpiruvato marcados com 13C, que podem gerar a partir do oxaloacetato duplamente marcado com 13C através da via da gluconeogénese, foram detectados mais na estirpe BsMDH-SACA do que na estirpe de controlo (BsMDH-28a). Assim, os nossos resultados indicaram que a via SACA é funcional para a produção de metabolitos derivados do acetil-CoA e acetil-CoA a partir de formaldeído.,avaliação da via SACA pelo crescimento celular
a fim de avaliar a via SACA in vivo, propusemos testar o crescimento celular passo a passo, alimentando cada intermediário na Via. Inicialmente, E. coli cresceu sob o meio rico e, em seguida, glicolaldeído foi adicionado como fonte de carbono suplementar. Adicionando diferentes concentrações de glicolaldeído (Figo suplementar. 20), descobrimos que a estirpe projetada que contém a via SACA com mais de 0.,O suprimento de glicolaldeído de 4 g De L−1 tem uma OD600 notável maior do que aquelas estirpes sem glicolaldeído ou a via SACA (Fig. 7a e Figo suplementar. 21). A contribuição do glicolaldeído para a biomassa (peso seco celular, CDW) foi de 0,681 ± 0,028 gCDWg−1 (n = 3) glicolaldeído.
avaliando a via SACA pelo crescimento celular. a Cell growth assays using 0.4 g L-1 glycolaldeído as supplemental carbon source., ensaios de crescimento de células b utilizando formaldeído de 80 mg L−1 como fonte de carbono suplementar. c ensaios de crescimento de células utilizando 8 g de metanol L−1 como fonte de carbono suplementar. As células inicialmente foram cultivadas em meio LB. Iptg foi adicionado para induzir a expressão proteica e, em seguida, as fontes de carbono suplementares foram adicionados. O OD600 foi detectado em diferentes pontos temporais., Por saca o esforço contém o vetor GALS-ACP-PTA-28-a, 28-a, a tensão contém o vector vazio da 28a, BsMDH-por saca o esforço inclui tanto BsMDH-pCDF e GALS-ACP-PTA-28a vetores, BsMDH-28a o esforço contém BsMDH-pCDF vetor e o vetor vazio 28a, Não GALS a tensão contém todos os genes no caminho, exceto os GALÕES, + adição suplementar de fonte de carbono, − sem suplemento de fonte de carbono, glycolaldehyde (GALD), formaldeído (FALD), metanol (MeOH). As barras de erro representam S. D.( desvio-padrão), n = 3. Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.,
quando testamos o crescimento celular usando formaldeído como fonte de carbono suplementar, o crescimento da estirpe com vetor vazio foi totalmente inibido por 80 mg L−1 de formaldeído (Fig. 7b). A estirpe que contém a via SACA foi inibida inicialmente e depois cresceu normalmente na mesma condição, o que pode ser causado pela sua taxa mais rápida de consumo de formaldeído do que a estirpe com vetor vazio (Figo suplementar. 22)., Infelizmente, a estirpe que contém a via SACA não tinha mais biomassa com Suplemento de formaldeído do que aqueles sem formaldeído. Estes resultados indicaram que, embora a via SACA seja mais eficiente para remover o formaldeído tóxico, não é suficiente para fornecer biomassa.finalmente, pretendíamos avaliar a via SACA alimentando metanol, que seria continuamente convertido em formaldeído. Descobrimos que a estirpe que contém tanto a via BsMDH como a via SACA tem uma OD600 mais elevada do que os controlos sem fornecimento de metanol ou a via SACA (Fig. 7C e Figo suplementar., 23). Após a incubação de 26 h, descobrimos que o valor de OD600 na estirpe que contém tanto a via BsMDH como a via SACA aumentou cerca de 0,2, o que é significativamente superior à estirpe sem a via SACA (valor P = 0, 005, teste T). Comparando com a estirpe sem a via SACA, descobrimos que a quantidade de biomassa derivada do metanol era 0,03 ± 0,006 gCDW g−1 (n = 3) metanol na estirpe que contém a via SACA.