Test oksydazy wykrywa obecność układu oksydazy cytochromu, który katalizuje transport elektronów między dawcami elektronów w bakteriach i barwnikiem redoks – tetrametylo-P-fenylenodiaminą. Barwnik jest zredukowany do koloru głębokiego fioletu., Test ten służy do pomocy w identyfikacji Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella i Pasteurella, z których wszystkie wytwarzają enzym oksydazy cytochromu.

do tego testu można użyć wielu odczynników.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organizmy zawierające cytochrom c jako część łańcucha oddechowego są oksydazo-dodatnie i zmieniają odczynnik na niebieski/fioletowy. Organizmy pozbawione cytochromu c jako części łańcucha oddechowego nie utleniają odczynnika, pozostawiając go bezbarwnego w granicach testu i są oksydazo-ujemne.

bakterie oksydazo-dodatnie posiadają oksydazę cytochromu lub oksydazę indofenolową (żelazo zawierające hemoproteinę). Oba te katalizują transport elektronów ze związków donorowych (NADH) do akceptorów elektronów (Zwykle tlenu)., Odczynnik badany, N, N, N', N ' -tetrametylo-P-fenylenodiamina dichlorowodorek działa jako sztuczny akceptor elektronów dla enzymu oksydazy. Utleniony odczynnik tworzy barwny związek błękit indofenolowy.

układ cytochromu występuje zwykle tylko u organizmów tlenowych, które są zdolne do wykorzystania tlenu jako końcowego receptora wodorowego. Produktem końcowym tego metabolizmu jest woda lub nadtlenek wodoru (rozkładany przez katalazę).

cel/zastosowania testu oksydazy

• test oksydazy jest używany do określenia, czy organizm posiada enzym oksydazy cytochromu.,
• test jest stosowany jako pomoc w różnicowaniu gatunków Neisseria, Moraxella, Campylobacter i Pasteurella (oksydaza dodatnia).
• jest również używany do odróżniania pseudomonadów od pokrewnych gatunków.

procedura testu oksydazy

istnieje wiele odmian metody testu oksydazy. Należą do nich, ale nie są ograniczone do testu bibułki filtracyjnej, metody płyty bezpośredniej, metody wymazu, impregnowanej metody paska testowego oksydazy i metody probówki. Wszystkie czasy i stężenia są oparte na oryginalnych zaleceniach.,

metoda suchego papieru filtracyjnego

ponieważ odczynnik oksydazy jest niestabilny i musi być świeżo przygotowany do użycia, metoda ta jest wygodna.

1. taśmy bibuły filtracyjnej Whatman ' s No.1 moczone są w świeżo przygotowanym 1% roztworze dichlorowodorku tertrametylu-P-fenyleno-diaminy.
2. po opróżnieniu przez około 30 sekund paski są liofilizowane i przechowywane w ciemnej butelce szczelnie zamkniętej zakrętką.
3. do użytku, pasek jest usuwany, układany w szalce Petriego i zwilżany wodą destylowaną.,
4. Kolonia, która ma być badana, jest odbierana za pomocą platynowej pętli i rozmazywana na wilgotnym obszarze.
5. reakcja pozytywna jest wskazywana przez intensywny odcień głębokiego fioletu, pojawiający się w ciągu 5-10 sekund, „opóźnioną reakcję pozytywną” przez zabarwienie w ciągu 10-60 sekund, a reakcję negatywną przez brak zabarwienia lub przez zabarwienie później niż 60 sekund.

metoda mokrego papieru filtracyjnego

1. pasek papieru filtracyjnego jest nasączony odrobiną świeżo wykonanego 1% roztworu odczynnika.
2. plamka Kultury wciera się na nią platynową pętlą.,
3. reakcja pozytywna jest wskazywana przez intensywny odcień głębokiego fioletu, pojawiający się w ciągu 5-10 sekund, „opóźnioną reakcję pozytywną” przez zabarwienie w ciągu 10-60 sekund, a reakcję negatywną przez brak zabarwienia lub przez zabarwienie później niż 60 sekund.

metoda płytki bezpośredniej

1. dodać 2 -3 krople odczynnika bezpośrednio do podejrzanych kolonii na płytce agarowej. Nie zalewaj płytki odczynnikiem.
2. Obserwuj zmianę koloru w ciągu 10 sekund.

Uwaga: metodę bezpośredniej płytki należy przeprowadzić na nieselektywnej płycie agarowej.,

1. podczas stosowania odczynnika oksydazy Kovaca mikroorganizmy są oksydazo dodatnie, gdy kolor zmienia się na Ciemnofioletowy w ciągu 5 do 10 sekund. Mikroorganizmy są opóźnione oksydazy dodatnie, gdy kolor zmienia się na fioletowy w ciągu 60 do 90 sekund. Mikroorganizmy są oksydazy ujemne, jeśli kolor nie zmienia się lub trwa dłużej niż 2 minuty.
2. podczas stosowania odczynnika Gordona i McLeoda mikroorganizmy są oksydazo dodatnie, gdy kolor zmienia się na czerwony w ciągu 10 do 30 minut lub na czarny w ciągu 60 minut. Mikroorganizmy są oksydazy ujemne, jeśli kolor nie zmienia się.,

metoda wymazu

1. zanurz wymaz do odczynnika, a następnie dotknij izolowanej podejrzanej Kolonii
2. Obserwuj zmianę koloru w ciągu 10 sekund.

metoda probówki

1. wyhodować świeżą hodowlę (18 do 24 godzin) bakterii w 4,5 ml bulionu odżywczego (lub standardowych mediów, które nie zawierają wysokiego stężenia cukru).
2. dodać 0,2 ml 1% α-naftolu, następnie dodać 0,3 ml 1% szczawianu P-aminodimetyloaniliny (odczynniki Gaby i Hadley).
3. energicznie wstrząsnąć, aby zapewnić mieszanie i dokładne dotlenienie Kultury.,
4. obserwuj zmiany kolorów.
5. mikroorganizmy są oksydazy dodatnie, gdy kolor zmienia się na niebieski w ciągu 15 do 30 sekund. Mikroorganizmy opóźniają oksydazę dodatnią, gdy kolor zmienia się na fioletowy w ciągu 2 do 3 minut. Mikroorganizmy są oksydazy ujemne, jeśli kolor nie zmienia się.

interpretacja wyniku testu oksydazy

wynik dodatni

rozwój koloru głębokiego fioletowo-niebieskiego / niebieskiego wskazuje na produkcję oksydazy w ciągu 5-10 sekund.

wynik ujemny

brak koloru fioletowo-niebieskiego/brak zmiany koloru.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Kontrola jakości testu oksydazy

kontrola pozytywna: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Kontrola negatywna: Escherichia coli ATCC 25922

ograniczenia testu oksydazy

1. odczynniki stosowane w teście oksydazy wykazują autooksydację, dlatego bardzo ważne jest stosowanie świeżych odczynników, nie starszych niż 1 tydzień.
2. zarówno bakterie, jak i drożdże hodowane na pożywkach zawierających wysokie stężenia glukozy wykazują zahamowaną aktywność oksydazy, dlatego zaleca się testowanie Kolonii hodowanych na pożywkach bez nadmiaru cukru, takich jak agar odżywczy., Tryptyczny agar sojowy jest również doskonałym medium.
3. bakterie hodowane na podłożach zawierających barwniki mogą dawać nieprawidłowe wyniki.
4. odczynniki testowe skutecznie zabijają mikroorganizmy, więc subkultura powinna być wykonana przed dodaniem jakiegokolwiek odczynnika do aktywnej Kultury.
5. test oksydazy może być stosowany w przypuszczalnej identyfikacji Neisseria oraz w różnicowaniu i identyfikacji prątków gram-ujemnych. Organizmy oksydazo-dodatnie powinny być badane przez plamę grama w celu określenia morfologii i reakcji grama., W celu pełnej identyfikacji zaleca się wykonanie dodatkowych badań biochemicznych.
6. zastosowanie nichromu lub innej pętli zawierającej żelazo może wywołać reakcje fałszywie dodatnie. Zalecane są pętle Platynowe.
7. Większość Hemofilów jest oksydazo-dodatnia. Mniej czułe paski lub odczynniki mogą dawać fałszywie ujemne wyniki.
8. reakcje oksydazy prątków gram-ujemnych należy oznaczać na nieselektywnych i niezróżnicowanych podłożach, aby zapewnić prawidłowe wyniki. Również kolonie pobrane z mediów zawierających wysoki poziom glukozy mogą dawać fałszywie ujemne reakcje.,
9. zaleca się stosowanie kolonii, które mają 18-24 godziny. Starsze kolonie wywołują słabsze reakcje.
10. wszelkie zmiany kolorów pojawiające się po 20 sekundach nie powinny być brane pod uwagę.