genetyczne połączenia między ścieżkami naprawy DNA a predyspozycjami do raka u ludzi wzbudziły zainteresowanie białkami, które rozpoznają i naprawiają określone miejsca uszkodzeń DNA. Enzymy naprawcze są niezwykle zachowywane od bakterii do grzybów do ludzi, podkreślając premię położoną na utrzymaniu integralności genomowej w obliczu obciążenia mutagennego., DNA jest podatne na uszkodzenia spowodowane błędami popełnionymi podczas replikacji i czynnikami środowiskowymi, takimi jak promieniowanie, utleniacze lub środki alkilujące. Reakcje naprawcze polegają na wycięciu chemicznie zmienionych lub źle dobranych zasad z dupleksu DNA. Powstałe luki są wypełniane przez polimerazy DNA; reakcja ta pozostawia nić w miejscu naprawy lub flankowania. Analogiczny proces zachodzi podczas replikacji chromosomalnej DNA, w którym segmenty 5 ' – RNA, które stanowią początek nieciągłej syntezy fragmentów Okazaki, są wycinane, a interwencyjne luki są wypełniane przez polimerazę DNA.,

ścieżki naprawy i replikacji DNA zbiegają się na wspólnym końcowym etapie, w którym ciągłość naprawionej nici DNA jest przywracana przez ligazę DNA, enzym przekształcający nić w wiązania fosfodiestrowe. Nicki są potencjalnie szkodliwymi uszkodzeniami DNA, które, jeśli nie zostaną skorygowane, mogą prowadzić do śmiertelnych pęknięć podwójnych nici. W związku z tym całkowita utrata funkcji ligazy DNA jest śmiertelna.

reakcja ligazy DNA

ligazy DNA katalizują przyłączenie nici zakończonej 5′-fosforanem do nici zakończonej 3′-hydroksylem., Ligacja zależy od magnezu i kofaktora wysokoenergetycznego, ATP lub nad+. Mechanizm reakcji obejmuje 3 sekwencyjne reakcje przeniesienia nukleotydów. W pierwszym etapie atak nukleofilowy na alfa-fosfor ATP (adenozynotrójfosforan) lub nad+ (dinukleotyd nikotynamidowo-adeninowy) przez ligazę powoduje uwolnienie pirofosforanu lub NMN (mononukleotyd nikotynamidowy) i powstanie kowalencyjnego związku pośredniego (ligaza-adenylan), w którym AMP jest połączony wiązaniem fosfoamidowym (P-N) z grupą epsilon-amino lizyny., W drugim etapie AMP jest przenoszony do 5 '- końca nici DNA zakończonej 5′-fosforanem, tworząc DNA-adenylan-odwróconą pirofosforanową strukturę mostkową, AppN. W tej reakcji tlen 5′-fosforanowy nici DNA atakuje fosfor ligazy-adenylanu; łańcuch boczny lizyny w miejscu aktywnym jest grupą odchodzącą. W trzecim etapie ligaza katalizuje atak 3 ' – OH Nicka na ADENYLAN DNA, aby połączyć się z 2 polinukleotydami i wyzwolić AMP.

podział Filogenetyczny

organizmy żywe obejmują 3 domeny: eubacteria, archaeabacteria i eukarioty., Wszystkie organizmy kodują 1 lub więcej ligaz DNA. Ligazy są zgrupowane w 2 rodzinach, LIGAZACH zależnych od ATP i ligazach zależnych od NAD+, zgodnie z substratem nukleotydowym wymaganym do tworzenia ligazy-adenylanu. Ligazy DNA zależne od ATP występują we wszystkich 3 domenach. Nad + – zależne ligazy DNA (LigA) są wszechobecne u bakterii, gdzie są niezbędne dla wzrostu i stanowią atrakcyjne cele dla anty-infekcyjnego odkrycia leku. Ligazy zależne od NAD+spotykane są tylko sporadycznie poza domeną bakteryjną życia, np.,, u archaea halofilnego i niektórych wirusów DNA i prawdopodobnie zostały nabyte w tych taksonach poprzez horyzontalny transfer genów.

eukariotyczne ligazy komórkowe zależne od ATP

ligazy DNA zależne od ATP występują u wszystkich gatunków eukariotycznych. Komórki ssaków zawierają cztery izoenzymy ligazy DNA. Porównywanie sekwencji aminokwasów sugeruje, że podstawowa domena katalityczna wspólna dla wszystkich ligaz zależnych od ATP jest ozdobiona dodatkowymi domenami specyficznymi dla izoenzymów zlokalizowanymi na aminowej lub karboksylowej końcówce białek., Uważa się, że te flankujące segmenty pośredniczą w wiązaniu ligaz DNA ssaków z innymi białkami biorącymi udział w replikacji DNA, naprawie i rekombinacji. Izoenzymy ssaków są określane jako ligaza i, ligaza IIIa, ligaza IIIB i ligaza IV. ligaza DNA i jest 919-aminokwasowym polipeptydem, wyrażonym we wszystkich tkankach, który katalizuje łączenie fragmentów Okazaki podczas replikacji DNA, a także odgrywa rolę w naprawie DNA., Ligazy DNA IIIa (922 aminokwasy) i IIIb (862 aminokwasy) są produktami jednego genu; różnią się sekwencją aminokwasów tylko w ich karboksylowych końcówkach w wyniku alternatywnego splicingu mRNA. Ligaza IIIa ulega ekspresji wszechobecnej i bierze udział w naprawie DNA i jest niezbędna do funkcjonowania mitochondriów. Ekspresja ligazy IIIB ogranicza się do jąder, w szczególności do spermatocytów poddawanych mejozie. Ligaza DNA IV jest 911-aminokwasowym polipeptydem, który odgrywa rolę w naprawie dwuniciowych przerw DNA poprzez Nie homologiczne łączenie końcowe (NHEJ).,

komórki drożdży zawierają 2 oddzielnie zakodowane ligazy DNA, które są homologiczne do ligaz DNA ssaków I I IV, odpowiednio. Ligaza DNA i (Cdc9p) drożdży drożdżowych Saccharomyces cerevisiae jest niezbędna do wzrostu komórek. Eksperymenty genetyczne implikują ligazę I w uszczelnianiu fragmentów Okazaki i w zakończeniu naprawy wycięć DNA. Natomiast ligaza DNA drożdży IV nie jest niezbędna do wzrostu komórek. Jednak delecja genu LIG4 wywołuje fenotypy wskazujące, że ligaza IV katalizuje naprawę podwójnych przerw w niehomologicznym szlaku łączenia końcowego (NHEJ)., Drożdże budujące nie posiadają wyraźnego homologu ligazy DNA ssaków III.

wirusowe ligazy DNA zależne od ATP

bakteryjne wirusy DNA, takie jak bakteriofagi E. coli T4, T6, T7 i T3, kodują własne ligazy DNA zależne od ATP. Ligazy DNA zależne od ATP są również kodowane przez eukariotyczne wirusy DNA, które prowadzą część lub cały cykl replikacji w cytoplazmie. Należą do nich wirus krowianki, wirus afrykańskiego pomoru świń i wirus chlorelli PBCV1. Bakteriofagi i eukariotyczne wirusowe ligazy DNA są mniejsze niż ich komórkowe odpowiedniki., Ligaza DNA Krowiarki, 552-aminokwasowy polipeptyd, jest uderzająco podobny na poziomie sekwencji aminokwasów do ligazy DNA ssaków III. rzeczywiście, ligaza III jest bliżej spokrewniona z ligazą Krowiarki niż z ligazami ssaków i I IV. ligazy T4( 487 aminokwasów), T7 (359 aminokwasów), T3 (346 aminokwasów) i wirusa chlorelli (298 aminokwasów) są jeszcze mniejsze. Pokazaliśmy, że ligaza wirusa chlorelli może uzupełniać wzrost szczepu drożdży, w którym Gen ligazy DNA I został usunięty., Wynik ten sugeruje, że segmenty białka unikalne dla znacznie większej ligazy DNA I nie są niezbędne do wzrostu komórek drożdży.

wykrywanie przez ligazy DNA

zbadaliśmy interakcje ligaz eukariotycznych z DNA za pomocą enzymów kodowanych przez wirusy jako modeli. Ligaza DNA wirusa krowianki i ligaza DNA wirusa chlorelli tworzą dyskretny kompleks z pojedynczo naciągniętym ligandem DNA w przypadku braku magnezu, który można rozwiązać z wolnego DNA za pomocą natywnej elektroforezy z żelu poliakrylamidowego., Ligazy wirusowe nie tworzą stabilnych kompleksów z następującymi ligandami: (i) DNA zawierające lukę 1-nukleotydową lub 2-nukleotydową; (ii) szczelny duplex DNA produkt reakcji ligacji; (iii) pojedynczo odcięty duplex zawierający końcówkę 5′-OH w nicku zamiast 5′-fosforanu; lub (iv) pojedynczo odcięty duplex zawierający nić RNA po stronie 5′-fosforanowej nicku (10-15). Tak więc wirusowe ligazy DNA zależne od ATP mają wewnętrzną funkcję wykrywania Nicka.,

Rozpoznawanie Nicka przez ligazę DNA krowianki i ligazę DNA wirusa chlorelli zależy również od zajętości kieszeni wiążącej AMP na enzymie — tzn. mutacje miejsca aktywnego ligazy, które znoszą zdolność do tworzenia pośredniego ligazy-adenylanu, również eliminują rozpoznawanie Nicka; podczas gdy mutacja, która zachowuje tworzenie ligazy-adenylanu, ale inaktywuje kolejne etapy reakcji łączenia nici, nie ma wpływu na wiązanie się z zerwanym DNA., Sekwestracja pozahelicznego nukleotydu przez ligazę związaną z DNA przypomina mechanizm rozpoznawania i katalizy miejsca docelowego stosowany przez inne enzymy modyfikujące i naprawiające DNA.

chociaż cząsteczka 5′-fosforanowa jest niezbędna do wiązania ligazy wirusa chlorelli z uszkodzonym DNA, cząsteczka 3′-OH nie jest wymagana do rozpoznawania Nicka. Ligaza wirusa chlorelli wiąże się ze zwartym ligandem zawierającym 2′, 3’dideoksy i 5′ -fosforanową końcówkę, ale nie może katalizować adenylacji 5′-końca., Tak więc 3 ' – OH jest ważny dla Etapu 2 chemii, mimo że sam nie jest chemicznie przekształcany podczas tworzenia DNA-adenylanu.

aby wyznaczyć interfejs ligaza-DNA, zbadaliśmy miejsce wiązania ligazy na DNA. Rozmiar śladu egzonukleazy III ligazy związanej z pojedynczym Nickiem w dupleksowym DNA wynosi 19-21 nukleotydów. Ślad jest asymetryczny, rozciąga się od 8 do 9 nukleotydów po stronie 3 '- OH nick i od 11 do 12 nukleotydów po stronie 5 ' – fosforanowej.,

struktura krystaliczna eukariotycznej ligazy DNA-Adenylan

ligazy DNA wirusa chlorelli (ChVLig) jest najmniejszą znaną ligazą eukariotyczną zależną od ATP. Jako” minimalna ” ligaza DNA przedstawiła atrakcyjny cel do oznaczania struktury. Skrystalizowaliśmy ChVLig i określiliśmy jego strukturę w rozdzielczości 2 Å. Enzym składa się z większej domeny N-terminalnej nukleotydylotransferazy (Ntazy) i mniejszej domeny C-terminalnej OB z rozszczepem między nimi. Cząstka AMP była kowalencyjnie związana z Nz Lys27 w miejscu aktywnym., Tak więc mamy strukturę prawdziwego katalizatora pośredniego.

w obrębie domeny Ntazy znajduje się kieszeń wiążąca adenylan składa się z sześciu motywów peptydowych (i, Ia, III, IIIa, IV I V), które definiują nadrodzinę kowalencyjnego enzymu nukleotydylotransferazy, która obejmuje ligazy DNA i RNA oraz enzymy ograniczające mRNA. Motif I (KxDGxR) zawiera lizynę, z którą AMP łączy się kowalencyjnie w pierwszym etapie reakcji ligazy. Aminokwasy w wątkach Ia, III, IIIa, IV i V kontaktują się z AMP i odgrywają zasadniczą rolę w jednym lub kilku etapach szlaku ligacji., Domena OB składa się z pięciolinii antyparallel beta beczki plus helisy Alfa.

strukturalna podstawa rozpoznawania Nicka przez minimalną Ligazę „Pluripotentną” DNA

chociaż ChVLig nie posiada dużych N – lub C-końcowych domen flankujących znalezionych w eukariotycznych komórkowych ligazach DNA, może podtrzymywać wzrost mitotyczny, naprawę DNA i niehomologiczne połączenie końcowe w pączkujących drożdżach, gdy jest jedynym źródłem ligazy w komórce. ChVLig może nawet pełnić podstawowe funkcje lig3 ssaków w metabolizmie mitochondrialnego DNA., Zaproponowaliśmy, że ChVLig reprezentuje rozebraną ligazę” pluripotentną „ze względu na jej wewnętrzną funkcję wykrywania Nicka, której podstawa została podświetlona, gdy rozwiązaliśmy strukturę krystaliczną 2,3 Å z CHVLIG-AMP związanego z Nickiem 3′-OH/5 ' – PO4 w dupleksie DNA.

ChVLig Domena NTase wiąże się ze złamanymi i nienaruszonymi pasmami DNA w rowku głównym flankującym Nicka, a także w rowku mniejszym po stronie 3 ' – OH Nicka. Domena OB spaja się przez mały rowek na powierzchni dupleksu za nickiem., Nowy moduł „zatrzask” – składający się z pętli beta-spinki do włosów, która pochodzi z domeny OB-zajmuje główny rowek i uzupełnia zacisk obwodowy poprzez styki między końcówką pętli a powierzchnią domeny Ntazy. Zatrzask ma kluczowe znaczenie dla zamknięcia zacisku i jest kluczowym wyznacznikiem wykrywania Nicka.

porównanie struktur krystalicznych wolnego i związanego z Nickiem ChVLig-AMP ujawnia dużą rearanżację domeny towarzyszącą rozpoznawaniu Nicka., W wolnym ChVLig-AMP domena OB odbija się od domeny Ntazy, aby w pełni odsłonić powierzchnię wiążącą DNA nad kieszenią wiążącą AMP. Segment peptydowy, który ma stać się zatrzaskiem, jest nieuporządkowany w wolnej ligazie i wrażliwy na proteolizę. Ale ten segment jest chroniony przed proteolizą, gdy ChVLig wiąże się z dna. Wiązanie DNA wiąże się z prawie 180 obrotem domeny OB wokół obrotu, tak że wklęsła powierzchnia beczki beta ob pasuje do niewielkiego rowka DNA., To przejście wywołuje ruch 63 Å domeny OB i umieszcza zatrzask głęboko w głównym rowku DNA.

sieć interakcji z końcówkami 3′-OH i 5′-PO4 w miejscu aktywnym oświetlała mechanizm adenylacji DNA i krytyczne role AMP w wykrywaniu i katalizie. Dodanie kationu dwuwartościowego spowodowało uszczelnienie Nicka w crystallo, tym samym ustalając, że kompleks Nicka jest w dobrej wierze pośrednim w szlaku naprawy DNA.,

struktura ligazy DNA NAD+związanej z Adenylanem DNA

ligazy DNA nad+(określane jako LigA) są charakterystycznym i strukturalnie jednorodnym kladem enzymów występujących u wszystkich bakterii. E. coli (671-aa) jest prototypem tej rodziny. LigA ma modułową architekturę zbudowaną wokół centralnego rdzenia ligazy składającego się z domeny Ntazy i domeny OB. Rdzeń jest otoczony przez domenę N-terminalową „Ia” i trzy moduły terminalowe C: tetracysteina zinc-finger, helix-hairpin-helix (HhH) i domenę BRCT., Każdy etap ścieżki ligacji zależy od innego podzbioru domen Ligi, przy czym tylko domena NTase jest wymagana dla wszystkich etapów. Domena Ia jest unikalna dla ligaz zależnych od nad+, odpowiada za wiązanie cząsteczek NMN NAD+ i jest wymagana do reakcji z NAD+, tworząc półprodukt ligazy-AMP.

odkryliśmy, że zależna od nad+ligaza DNA E. coli może wspierać wzrost szczepów Saccharomyces cerevisiae usuniętych pojedynczo dla CDC9 lub podwójnie dla CDC9 plus LIG4., Jest to pierwsza demonstracja, że enzym zależny od NAD+jest biologicznie aktywny w organizmie eukariotycznym. Późniejsze badania (we współpracy z Marią Jasin) wykazały, że E. coli może wystarczyć do funkcji ligazy w komórkach es myszy pozbawionych niezbędnego enzymu Lig3.

nasza struktura krystaliczna E. coli związana z naciągniętym pośrednim DNA-adenylanem ujawniła, że LigA również otacza helisę DNA jako zacisk białkowy w kształcie litery C. Interfejs białko-DNA pociąga za sobą rozległe kontakty DNA przez domeny Ntazy, OB i HhH na 19-bp segmencie dupleksu DNA wyśrodkowanego wokół Nicka., Domena NTase wiąże się ze złamanymi pasmami DNA w nicku i flankuje Nicka, domena OB styka się z ciągłym pasmem szablonu otaczającym Nicka, a domena HhH wiąże oba pasma w mniejszym rowku na obrzeżach śladu. Moduł Zn-finger odgrywa strukturalną rolę w łączeniu domen OB i HhH. Domena Ia nie styka się z dupleksem DNA, co jest zgodne z jego dyspensownością do katalizy zamknięcia nici na substracie AppDNA.,

domeny Ntazy i OB są umieszczone podobnie na obwodzie DNA, jak domeny Ntazy i OB zależnych od ATP ligaz DNA i „odciskają” podobne segmenty nici DNA. Jednak topologia zacisku Ligazowego bardzo różni się od zacisków utworzonych przez ChVLig i ligazę ludzkiego DNA 1 (HuLig1, wyznaczoną przez Toma Ellenbergera i współpracowników). Styki całkujące zamykające zacisk są sui generis, obejmujące domenę NTase i domenę C-terminal HhH., Na podstawie dostępnych danych strukturalnych jest jasne, że ligazy DNA wyewoluowały co najmniej trzy różne sposoby otaczania DNA.

porównanie kompleksu E. coli LigA—AppDNA ze strukturami innych ligaz bakteryjnych wychwyconych jako kompleks binarny LigA•—NAD+ (substrat 1), kompleks binarny LigA•—NMN (Grupa po opuszczeniu etapu 1) i ligaza kowalencyjna AMP intermediate (produkt Etap 1 po opuszczeniu dysocjacji grupy) uwypukla masywne zmiany domen białkowych (rzędu 50 do 90 Å), które występują w synchronizacji z wiązaniem substratowym i katalizą., Wiązanie DNA i tworzenie zacisku przez Ligę pociąga za sobą prawie 180 obrotów domeny OB tak, że wklęsła powierzchnia beczki Beta ob pasuje do niewielkiego rowka, podobnego do tego, co jest widoczne lub wnioskowane dla ChVLig i HuLig1. Czteropunktowe Wiązanie domeny HhH na obrzeżach śladu DNA stabilizuje gięcie DNA wyśrodkowane na nicku. Interakcje LigA-DNA natychmiast otaczające Nicka wywołują lokalne zniekształcenie DNA, w wyniku czego przyjmuje się helisę RNA-podobną do formy a, ponownie potwierdzając wyniki dla cocrystalu HuLig1-DNA.,

Mechanizm adenylacji lizyny przez ligazy POLINUKLEOTYDOWE zależne od ATP i NAD+

reakcja autoadenylacji ligaz polinukleotydowych jest wykonywana przez domenę nukleotydylotransferazy (Ntazy), która jest zachowana w LIGAZACH DNA i RNA zależnych od ATP oraz ligazach DNA zależnych od NAD+. Domena Ntazy obejmuje definiowanie motywów peptydowych, które tworzą kieszeń wiążącą nukleotydy. Motif I (KxDG) zawiera lizynę, która zostaje kowalencyjnie przyłączona do AMP. Jak zauważył Robert Lehman w 1974 roku, nie jest jasne, w jaki sposób lizyna (o przewidywanej wartości pKa wynoszącej ~10.,5) traci swój proton w fizjologicznym pH, aby osiągnąć stan nieprotonowany wymagany do ataku na α fosforu ATP lub nad+. W zasadzie ligaza może wykorzystywać ogólną zasadę do deprotacji lizyny. Alternatywnie, pKa może być napędzany przez dodatni potencjał ładunku aminokwasów białkowych otaczających lizynę-Nz. Kilka struktur krystalicznych ligaz nieobecnych metali zapewniało skąpe wsparcie dla obu wyjaśnień. W tych strukturach nukleofil lizyny motif i znajduje się obok łańcucha bocznego motif IV glutaminianu lub asparaginianu., Lizyna i karboksylan motif IV tworzą parę jonową, której przewidywany efekt polega na zwiększeniu pKa lizyny poprzez otaczający ładunek ujemny. Jest mało prawdopodobne, aby anion glutaminianowy lub asparaginianowy mógł służyć jako ogólna podstawa do abstrakcji protonu z kationu lizyny. Potencjalnym rozwiązaniem problemu byłoby, gdyby kation dwuwartościowy opuścił lizynę-Nz i obniżył jej pKa.,

mechanizm napędzany metalem został ujawniony przez niedawną strukturę krystaliczną ligazy RNA naegleria gruberi (NgrRnl) jako kompleks etapowy z ATP i manganem (preferowanym kofaktorem metalu). Kluczem do uchwycenia kompleksu Michaelisa było zastąpienie nukleofila lizyny izosteryczną metioniną. Struktura 1,9 Å zawierała ATP i dwa jony manganu w miejscu aktywnym. „Katalityczny” metal był koordynowany geometrią oktaedralną do pięciu wód, które z kolei koordynowane były przez karboksylowe łańcuchy boczne zachowanych pozostałości w I, III i IV., Szóste miejsce ligandu w katalitycznym kompleksie metali zajmował tlen fosforanowy ATP α, co wskazuje na rolę metalu w stabilizacji stanu przejściowego reakcji autoadenylacji. Kluczowy wgląd, wzmocniony przez superpozycję kompleksu Michaelisa na strukturze kowalencyjnego związku NgrRnl–(LYS-NZ) – AMP, dotyczył roli katalitycznego kompleksu metalowego w stabilizowaniu nie protonowanego stanu nukleofila lizyny przed katalizą, poprzez lokalny ładunek dodatni i kontakt atomowy Lys-Nz do jednej z wód związanych z metalem., Kompleks Michaelisa NgrRnl ujawnił drugi metal, skoordynowany oktaedralnie z czterema wodami i TLENAMI fosforanowymi ATP β i γ. Kompleks metalowy i fosforan ATP γ były zaangażowane przez zespół łańcuchów bocznych aminokwasów (unikalnych dla NgrRnl), które wspólnie ukierunkowują grupę apikalną PPI na nukleofil lizyny. Zgodnie z jednoetapowym mechanizmem in-line fosforan α został stereochemicznie odwrócony podczas przejścia z kompleksu NgrRnl * ATP Michaelisa do półproduktu LIZYLO-AMP., uważa się, że ligazy DNA ewoluowały oddzielnie od ligaz RNA, początkowo przez fuzję przodkowej domeny NTAZY wykorzystującej ATP do domeny C-terminalnej domeny OB (obejmującej minimalny rdzeń katalityczny ligazy DNA), a następnie przez fuzję dodatkowych modułów strukturalnych do rdzenia Ntazy-OB (7). Nad + – zależne ligazy DNA (enzymy Ligazowe), które są wszechobecne u bakterii i niezbędne dla żywotności bakterii, nabrały swoistości dla nad + poprzez fuzję modułu domeny Ia wiążącej NMN do n-końca domeny Ntazy., Ligaza DNA Escherichia coli (EcoLigA) była pierwszą komórkową ligazą DNA odkrytą i scharakteryzowaną i pozostaje głównym modelem Badań Strukturalnych i funkcjonalnych zależnej od nad+rodziny ligaz DNA. Zainteresowanie mechanizmem LigA jest napędzane obietnicą ukierunkowania LigA (poprzez jego specyficzność substrat NAD+ i unikalne cechy strukturalne w stosunku do ludzkich ligaz DNA) na odkrycie leków antybakteryjnych.

rozwiązaliśmy 1,55 Å strukturę krystaliczną Ecoligi jako kompleks Michaelisa z NAD+ i magnezem., Struktura ujawnia jeden metalowy mechanizm, w którym związany z Ligazą kompleks Mg2+(H2O)5 obniża PKA lizyny i angażuje fosforan nad+ α, ale fosforan β i nukleozyd nikotynamidowy grupy opuszczającej NMN są zorientowane wyłącznie poprzez interakcje atomowe z elementami białkowymi, które są unikalne dla kladu LigA. Dychotomia dwóch metali (dla ligazy zależnej od ATP) w porównaniu z jednym metalem (dla ligazy zależnej od NAD+) wyznacza punkt rozgałęzienia w ewolucji ligazy.