metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zaczęły pojawiać się w literaturze w połowie lat 2000 i miały transformacyjny wpływ na nasze zrozumienie genomiki drobnoustrojów i chorób zakaźnych. Istnieje jednak znaczne kontrowersje na temat tego, jak, kiedy i gdzie sekwencjonowanie nowej generacji będzie odgrywać rolę w klinicznym laboratorium diagnostycznym., Deep Dive point-counterpoint dyskusja z Journal of Clinical Microbiology omawia wyzwania i możliwości, które mogą przyjść z wprowadzeniem metagenomic next generation sequencing (mNGS) Do Rutynowych laboratoriów. Czym dokładnie jest mNGS i czym różni się od wielu innych technologii kwasu nukleinowego?

co to jest Metagenomic next Generation Sequencing?

sekwencjonowanie nowej generacji jest jedną z kilku wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania, w których miliardy fragmentów kwasu nukleinowego mogą być jednocześnie i niezależnie sekwencjonowane., Kontrast ten technika klasyczny metoda tak jak Sanger sekwencjonowanie (znany także jako dideoxynucleotide chain termination sekwencjonowanie), który przetwarza jeden nukleotyd Sekwencja per reakcja.
aby scharakteryzować Genom bakterii za pomocą NGS, na przykład, Genom jest podzielony na wiele fragmentów, które wytwarzają sekwencje lub odczyty o długości od setek do kilkudziesięciu tysięcy zasad. Sekwencje są montowane w jednym genomie przy użyciu metod obliczeniowych. Kilka nakładających się odczytów sekwencji jest składanych razem, aby stworzyć jedną dłuższą sekwencję zwaną contig., Często występują luki między kontigami i chociaż dłuższa Sekwencja odczytów o wysokiej wierności byłaby idealną metodą sekwencjonowania, platformy, które wytwarzają krótsze odczyty, są na ogół mniej kosztowne, a nakładanie się sekwencji czyni je bardziej dokładnymi. Skonstruowany Genom (prawdopodobnie zawierający luki) jest dopasowany do referencyjnej bazy danych w celu identyfikacji organizmu. Technologia ta stanowi znaczny postęp w pierwszych dniach sekwencjonowania, gdy pojedynczy projekt genomu bakteryjnego może potrwać kilka lat.,
Metagenomic NGS (mNGS) po prostu uruchamia wszystkie kwasy nukleinowe w próbce, która może zawierać mieszane populacje mikroorganizmów, i przypisując je do ich genomów odniesienia, aby zrozumieć, które drobnoustroje są obecne i w jakich proporcjach. Zdolność do sekwencji i identyfikacji kwasów nukleinowych z wielu różnych taksonów do analizy metagenomicznej sprawia, że jest to potężna nowa platforma, która może jednocześnie identyfikować materiał genetyczny z zupełnie różnych królestw organizmów.,

możliwe zastosowania kliniczne są ogromne, w tym diagnostyka chorób zakaźnych, śledzenie ognisk, nadzór nad kontrolą zakażeń, wykrywanie mutacji i patogenów, między innymi. mNGS, czasami nazywany Shotgun sekwencjonowania, próbek klinicznych został zastosowany do różnych typów próbek, w tym płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi, próbek oddechowych, płynu żołądkowo-jelitowego i płynu ocznego.

jakie są zalety sekwencjonowania Metagenomicznego nowej generacji?,

największą siłą mNGS jest to, że jest to bezstronna metoda diagnostyczna wolna od hipotez, w przeciwieństwie do metod ukierunkowanej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które polegają na podkładach do identyfikacji konkretnych celów, które mają być amplifikowane i wykryte. Nawet uniwersalne lub Szeroko zakrojone metody PCR nie są wystarczająco szerokie, aby można je było uznać za metagenomiczne, ponieważ używają specyficznych podstawników konserwowanych genów 16S rybosomalnego RNA (rRNA) i wewnętrznych transkrybowanych sekwencji spacerowych (ITS) w celu wzmocnienia charakterystycznych sekwencji kwasów nukleinowych, które mogą być bioinformatycznie klasyfikowane do bakterii/archeea, lub grzybów odpowiednio.,
podkłady uniwersalne stanowią również problem przy diagnozowaniu infekcji polikrobiologicznych za pomocą testów molekularnych. Jeśli populacje polimikrobiologiczne są obecne przy użyciu sekwencjonowania 16S, wiele zasad wywołania będą wykonane na nukleotyd, produkując mieszany chromatogram nukleotydowy, który nie może być interpretowany. Chociaż istnieją de-convolutional metody obliczeniowe dostępne do przewidywania organizmów zidentyfikowanych, nie są one w standardowym użyciu dla wielu laboratoriów, które często odruchu do następnej generacji sekwencjonowania genu 16S dla próbek polimikrobiologicznych.,

jakie są wyzwania związane z sekwencjonowaniem Metagenomicznym nowej generacji?

pomimo potencjału mNGS, istnieje wiele barier do usunięcia, zanim technologia może stać się częścią głównego nurtu laboratorium, a także luki w naszym zrozumieniu jego użyteczności diagnostycznej. Główne zastrzeżenia obejmują interpretację wyników (odróżnienie skażenia i kolonizacji od prawdziwych patogenów), wybór i walidację baz danych wykorzystywanych do analiz oraz przewidywanie (lub ich brak) podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe., Powszechnie uważa się, że mNGS jest tak niewiarygodnie wrażliwy, że ujawni diagnozę, gdy wszystkie inne testy będą negatywne. Podczas gdy mNGS może analitycznie bardziej wrażliwe niż standardowe metody hodowli w niektórych przypadkach, konieczne usunięcie ogromnych ilości ludzkiego kwasu nukleinowego podczas sekwencjonowania przygotowania i (metodami obliczeniowymi) podczas POST-analytic procesu, może zmniejszyć czułość w porównaniu do ukierunkowanych podejść PCR dla wielu organizmów.

specyfika mNGS pozostaje przysłowiowym słonikiem w pokoju., Zanieczyszczenie próbek podczas pobierania próbek jest dużym problemem ze względu na zwiększoną czułość analityczną mNGS w porównaniu do standardowych metod hodowli, i nie musi być zatwierdzony proces kontroli jakości w miejscu dla etapów od oceny czystości odczynnika do pomiaru odpowiedniego pokrycia kontroli genomu. Co więcej, w przypadku niektórych platform Illumina można wyznaczyć niewłaściwe indeksy kodów kreskowych, co prowadzi do fałszywych alarmów w sekwencjonowaniu danych., Bioinformatyczne kontrole jakości są potrzebne, aby zapewnić, że wysokiej jakości i zwalidowane genomy są dostępne z minimalnymi błędami bazy danych i nie byłoby idealnie personel bioinformatyczny dostępny do interpretacji wyników sekwencjonowania dla każdego testu, który nie jest dostępny w większości klinicznych laboratoriów mikrobiologicznych., Federalna Administracja Leków (FDA) współpracowała z innymi agencjami federalnymi w celu stworzenia bazy danych o nazwie FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), która była przydatna do zapewnienia, że obecne wyniki mNGS są wiarygodne i dokładne, ale te zasoby muszą być aktualizowane i utrzymywane.
pozostaje jeszcze większe pytanie dotyczące klinicznej specyfiki mNGS: czy wykryte sekwencje z patogenów, które przyczyniają się do aktualnej choroby pacjenta?, Specyficzność analityczna badań mNGS może być adresowana z rygorystycznymi kontrolami w całym zbiorze próbek, przygotowaniu biblioteki sekwencjonowania, uruchomieniu testu i klasyfikacji bioinformatycznej, ale specyficzność kliniczna nie jest bezpośrednio adresowana przez te podejścia. Pytania, które mogą pomóc określić przydatność kliniczną i przydatność obejmują: Jak możemy odróżnić organizmy związane z przejściową bakteriemią od flory doustnej / żołądkowo-jelitowej lub kolonizatorów skóry w badaniu mngs krwi/osocza?, Jak należy zgłosić głębokość sekwencjonowania i jak wiarygodny jest związek głębokości sekwencji do prawdziwego zakażenia? Czy ta relacja różni się w zależności od patogenu / gospodarza? Jak długi jest oczekiwany wykrywalny okres półtrwania patogenu przez mNGS, gdy pacjent jest poddawany odpowiedniej terapii leczniczej? Badania użyteczności klinicznej i opłacalności są bardzo potrzebne pomimo niepodważalnej mocy tej technologii z perspektywy badań i odkryć.,
warto również zwrócić uwagę, że nie istnieją obecnie zatwierdzone przez FDA lub zatwierdzone testy mNGS, które mogą być wysyłane do badań mikrobiologicznych, chociaż istnieją laboratoria certyfikowane zgodnie z poprawkami poprawy klinicznej laboratorium z 1988 roku (CLIA ’88), które oferują badania na próbkach klinicznych. Do tej pory tylko kilka diagnostycznych systemów NGS zostało zatwierdzonych przez FDA do badań onkologicznych lub wykrywania mukowiscydozy, na przykład., W niedawnym przeglądzie szczegółowo opisano wiele przeszkód regulacyjnych i rozważań, które będą musiały zostać rozwiązane, zanim mNGS będzie mógł wejść do głównego nurtu klinicznych laboratoriów diagnostycznych jako test zatwierdzony przez FDA.
podsumowując, chociaż badania mNGS mogą prawdopodobnie odgrywać ważną rolę w procesie diagnostyki mikrobiologicznej w przyszłości, szczególnie w miarę rozwoju sekwencjonowania i bioinformatycznej mocy przetwarzania, pozostaje to technologią o wysokiej złożoności, dla której użyteczność kliniczna w naszym obecnym środowisku praktyki medycznej pozostaje niepewna., Chociaż badania mNGS mogą zaoferować nowe i ekscytujące możliwości diagnostyczne w niedalekiej przyszłości, żadne z nich prawdopodobnie nie zastąpi bystrego lekarza w najbliższym czasie.