Po studiach w Radzie w latach 1992-1995, Macfadyen stał się znany w brytyjskim Teatrze przede wszystkim ze współpracy ze sceną Cheek by Jowl, dla której grał Antonio w księżnej Malfi, Charlesa Surface w szkole skandalu i Benedicka w wiele hałasu o nic. Wcielał się w postać oficerskiego bufona z wąsami i rozbawionym śmiechem. W 2005 roku zagrał księcia Hala w Henryku IV, Parts One and Two w Royal National Theatre, z Michaelem Gambonem w roli Falstaffa., W 2007 roku powrócił na scenę, wcielając się w postać Amerykanina Claya, ojca z liberalną postawą w sztuce ból i swędzenie.
przełom w telewizji nastąpił, gdy pojawił się jako Hareton Earnshaw w adaptacji Wichrowych Wzgórz, wyświetlanej w sieci ITV w 1998 roku. W 1999 roku wystąpił w serialach Warriors (1999) i The Way We Live Now (2001). Również w 2001 roku zdobył uznanie za główną rolę w serialu BBC Two Perfect Strangers, który został napisany i wyreżyserowany przez Stephena Poliakoffa., W 2002 roku wystąpił w serialu BBC „the Project”, opowiadającym o dojściu do władzy New Labour. Wystąpił w serialu Spooks, który stał się sukcesem, gdy wyświetlany był w BBC One. Drugi sezon został wyemitowany w 2003 roku, a trzeci sezon został wyemitowany jesienią 2004 roku. Seria była emitowana jako MI-5 W Sieci A&. W 2007 roku pojawił się w jednorazowym dramacie Channel 4 Secret Life, który poruszał kontrowersyjny temat pedofilii., Macfadyen zdobył nagrodę dla najlepszego aktora podczas Royal Television Society 2007 Awards za tę rolę i był nominowany do BAFTA. Pojawił się również w krótkim skeczu dla Comic Relief jako pan młody w Weselu Pana fasola, u boku Rowana Atkinsona i Michelle Ryan.
Macfadyen pojawił się w filmach, w tym Enigma (wydany w 2001), i in my father ' s Den, za którą otrzymał nagrodę New Zealand Screen Award dla najlepszego aktora., W 2005 roku wystąpił jako romantyczny aktor Fitzwilliam Darcy w adaptacji Pride and Prejudice, wydanej w Wielkiej Brytanii.
Macfadyen zagrał w filmie Frank Oz 's Death at a Funeral oraz filmie Incendiary na podstawie powieści Chrisa Cleave' a u boku Michelle Williams i Ewana McGregora. Pojawił się także w filmie Rona Howarda Frost/Nixon, w którym zagrał Johna Birta. W 2008 roku zagrał główną rolę Arthura Clennama w adaptacji małej Dorrit Charlesa Dickensa., W 2009 roku Macfadyen pojawił się u boku nominowanej do Oscara aktorki Heleny Bonham Carter w filmie BBC Four Enid, opartym na życiu Enid Blyton, jako Hugh Pollock, wydawca i pierwszy mąż Blytona.
w 2010 roku zagrał szeryfa Nottingham w Robin Hoodzie. Wystąpił jako Przeor Philip w serialu Filary Ziemi, i był w średnim wieku Logan Mountstuart w każdym ludzkim sercu. W czerwcu 2010 roku Macfadyen zdobył nagrodę Brytyjskiej Akademii Telewizyjnej dla najlepszego aktora drugoplanowego za pracę w „Criminal Justice”.,
w 2011 roku Macfadyen wystąpił w serialu Spooks BBC, a w 2012 roku zagrał Oblonsky ' ego w filmie Joego Wrighta, Anna Karenina. W grudniu 2012 zaczął wcielać się w detektywa Inspektora Edmunda Reida w serialu BBC One „Ripper Street”.
w latach 2013-2014 grał Jeevesa w inscenizacji Jeevesa i Woostera w Perfect Nonsense w Duke of York ' s Theatre Na West Endzie Londynu. Sztuka zdobyła nagrodę Oliviera w 2014 roku dla najlepszej nowej komedii.
w 2015 roku Amazon Prime podbił Ripper Street i, po dobrych recenzjach, został wznowiony na czwarty i piąty sezon., Macfadyen powiedział, że jest „zachwycony kolejną dawką ulicy Rozpruwacza-krwią i wnętrznościami – kieszonkowymi zegarkami i wiktoriańskim nakryciem głowy, cudownie mrocznymi, poruszającymi i tajemniczymi fabułami Richarda Wardlowa”. Serial emitowany był także w Stanach Zjednoczonych na kanale BBC America. W 2015 roku wystąpił gościnnie w pilotażowym odcinku „The Last Kingdom”.
obecnie występuje w roli Toma Wambsgansa w serialu HBO, za który otrzymał nominację do nagrody Primetime Emmy.,
w 2020 roku pojawił się w roli majora Charlesa Ingrama w trzyczęściowym dramacie ITV Quiz, opartym na kontrowersyjnym skandalu „Who Wants To Be A Millionaire” z 2001 roku.