Budowa syntetycznego szlaku acetylo-CoA
najprostszym sposobem syntezy węgla organicznego z jednego węgla jest konstruowanie go jeden po drugim., Aby zbudować sztuczny szlak acetylo-CoA z jednego węgla, zaproponowaliśmy syntetyczny szlak acetylo-CoA (SACA), w którym dwie cząsteczki Formaldehydu zostałyby przeniesione do jednej cząsteczki acetylo-CoA tylko w trzech krokach (rys. 1a). Po pierwsze, formaldehyd byłby skondensowany do aldehydu glikolowego (GALD) przez syntazę aldehydu glikolowego (GALS). A następnie aldehyd glikolowy zostanie przekształcony w Acetylo-fosforan (AcP) przez syntazę Acetylo-fosforanową (ACPS) przy użyciu nieorganicznego fosforanu. Wreszcie, AcP zostałby wykorzystany do produkcji acetylo-CoA przez znany enzym acetylotransferazę fosforanową (PTA)25., Tymczasem formaldehyd można otrzymać poprzez redukcję dwutlenku węgla i mrówczanu 26 lub utlenianie metanu i metanol27. W ten sposób możemy zrealizować biosyntezę acetylo-CoA z formaldehydu, a nawet innych zasobów jednowęglowych.
opis i analiza obliczeniowa szlaku SACA. szlak SACA został wyróżniony na czerwonym panelu. Głównym surowcem Formaldehydu może być metanol, mrówczan, a nawet metan i CO2., Produkt acetylo-CoA może być używany do wytwarzania głównych składników odżywczych komórkowych. b dane termodynamiczne trzech zaprojektowanych szlaków syntezy acetylo-CoA zostały wygenerowane przez stronę internetową equilibratora (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG ' m: całkowita zmiana energii Gibbsa; kroki: liczba reakcji z formaldehydu do acetylo-CoA w badanych szlakach; MDF: Maksymalna siła napędowa; plony: Całkowita wydajność węgla w badanych szlakach; koenzymy: liczba koenzymów jest używana w badanych szlakach
Termodynamika może odzwierciedlać, czy Szlak może być skutecznie przenoszony in vivo Lub in vitro. Obliczyliśmy termodynamiczną siłę napędową zaprojektowanego szlaku SACA., Ogólna reakcja z formaldehydu do acetylo-CoA jest bardzo korzystna termodynamicznie, gdzie całkowita zmiana energii Gibbsa (ΔrG ' m)całej reakcji wynosi około -96,7 kJ mol-1 (rys. 1b i uzupełniająca Tabela 1). Wartość MDF (maximum driving force) jest zwykle używana do oceny jakości termodynamicznej i kinetycznej różnych ścieżek28. Jeśli płyta MDF jest wystarczająco wysoka, ścieżka nie zawiera termodynamicznych wąskich gardeł, które utrudniałyby jej działanie in vivo. Droga SACA uzyskała stosunkowo wysoką wartość MDF 26.,9 kJ mol-1, który jest oczywiście wyższy niż ścieżki FLS i MCC (ich wartości MDF to odpowiednio 1,9 i 5,8 kJ mol−1). Dlatego szlak SACA jest termodynamicznie korzystny dla biosyntezy acetylo-CoA z formaldehydu.
Identyfikacja nowego enzymu od C1 do C2
kondensacja Formaldehydu może być katalizowana przez N-heterocykliczny Karabinek w chemii29,30. W biologii pierścień tiazoliowy kofaktora difosforanu tiaminy (ThDP) ma podobną funkcję, która może aktywować jeden aldehyd, a następnie tworzyć dimer z innym aldehydem31., Aby znaleźć enzym do kondensacji dwóch cząsteczek formaldehydu w jedną cząsteczkę aldehydu glikolowego, odwołaliśmy się do mechanizmów katalitycznych enzymów zależnych od thdp i skonstruowaliśmy model teozymowy, który obejmuje ThDP, aldehyd glikolowy i kwas glutaminowy, który dostarcza elektronów do reakcji. 2A). Wszystkie enzymy w Protein Data Bank (PDB) zostały praktycznie zbadane w oparciu o model teozyme i uzyskano 37 zbędnych struktur białkowych z ligandem ThDP (rys. 1 i nota uzupełniająca)., Zgodnie z mechanizmami katalitycznymi enzymów zależnych od thdp 33,34,35, atom C2 w ThDP jest centrum aktywnym. Odległość między atomem C2 a produktem aldehydu glikolowego ma kluczowe znaczenie dla wywołania reakcji katalitycznej (rys. 2A). W ten sposób przeanalizowaliśmy odległość między atomem C2 a aldehydem glikolowym w każdym kandydującym białku.
Budowa Modelu Teozymowego i identyfikacja funkcjonalna syntazy aldehydu glikolowego., a interakcja modelu teozymowego między aldehydem glikolowym a aktywnymi centrami różnych enzymów zależnych od ThDP. Glutaminian (glu) jest tan; aldehyd glikolowy jest cyjan; ThDP jest zielony. Odległości między atomem C2 w ThDP i atomami węgla aldehydu glikolowego są reprezentowane przez d1 i d2. Zielona kropka to jon magnezu. b średnie odległości (niebieskie) między d1 i d2 w każdym białku są pokazane po lewej stronie. Ilość produktu (żółta) dla badanego białka jest pokazana po prawej stronie. Reakcję przeprowadzono poprzez dodanie 1 mg mL−1 badanych białek i 2 g Formaldehydu L−1. ND nie wykrywa., Paski błędów reprezentują s. d. (odchylenie standardowe), n = 3. ekspresja białka c trzech funkcjonalnych kandydatów za pomocą 1 mL 1 komórek OD. M: marker białkowy; 1, 3 i 5 reprezentują ekspresję białka bez IPTG odpowiednio dla 2UZ1, 3fzn i 4K9Q; 2, 4 i 6 reprezentują ekspresję białka pod indukcją IPTG odpowiednio dla 2uz1, 3fzn i 4K9Q; czerwone strzałki wskazują pasma białka odpowiednio dla 2uz1, 3fzn i 4K9Q. Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.,
na podstawie średnich odległości w każdym białku przy użyciu dokowania molekularnego (dane uzupełniające 1)36, sześciu kandydatów z krótkimi odległościami i wyraźnymi adnotacjami funkcjonalnymi zdefiniowano jako kandydatów (rys. 2b i dodatkowa Tabela 2). Ponadto, trzy białka o dużych odległościach zostały losowo wybrane jako kontrolki. Kandydaci i kontrole zostały wyrażone i oczyszczone, aby sprawdzić ich zdolność do wytwarzania aldehydu glikolowego z formaldehydu., Trzech z sześciu kandydatów wykazywało pożądaną aktywność, podczas gdy trzy kontrolki nie miały tej funkcji, wskazując na odległość między atomem C2 a aldehydem glikolowym odgrywa kluczową rolę w kondensacji Formaldehydu. Wśród trzech aktywnych kandydatów stwierdzono, że białko 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1), określane jako liaza benzaldehydowa (BAL), preferencyjnie generuje dihydroksyaceton (DHA), pomimo minimalnej wydajności aldehydu glikolowego, gdy stężenie formaldehydu było niższe37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
ukierunkowana ewolucja syntazy glikolaldehydu
ponieważ BAL został zaprojektowany do produkcji DHA z formaldehyde22, zaproponowaliśmy wykrycie, czy odpowiednie mutacje w BFD przyczyniłyby się również do poprawy aktywności enzymu (dodatkowe rys. 2). Przesiewając wszystkie zmutowane pozostałości, rzeczywiście znaleźliśmy wysoce aktywną mutację w86r-N87T, która znajdowała się w kanale substratu BFD (dodatkowe rys. 3). W ten sposób mutacja ta (W86R-N87T) została wprowadzona do BFD i wariant oznaczono jako M1., W celu dalszej poprawy aktywności katalitycznej BFD zaproponowaliśmy przesiewanie wszystkich pozostałości wokół centrum aktywnego BFD, gdzie wybrano 25 pozycji w odległości 8 Å od centrum aktywnego, aby wykonać jednopunktową mutagenezę nasycenia (rys. 4). Opracowaliśmy wysokowydajne podejście przesiewowe do wykrywania aldehydu glikolowego za pomocą reakcji barwnej między aldehydem glikolowym i difenyloaminą, która została zmierzona za pomocą spektrofotometrycznego monitora przy 650 nm (dodatkowe rys. 5)., Po badaniu okazało się, że 14 z 25 pozycji wykazywało wyższą aktywność niż mutant M1 (dodatkowe rys. 6). Następnie 14 pozycji podzielono na 8 grup: A( N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378) i H (T379 / T380). N27 był używany trzykrotnie, ponieważ warianty na tym stanowisku wykazywały największą aktywność. Używając M1 jako szablonu, wprowadziliśmy każdą grupę mutacji do M1 i wybraliśmy najwyższy aktywny mutant, który został oznaczony jako M2., Wykonując trzy rundy iteracyjnej mutagenezy kombinatorycznej wśród tych pozycji, całkowicie prześledziliśmy 64 512 klonów i uzyskaliśmy mutant o wysokiej aktywności, który zawiera pięć nowych mutacji wokół centrum aktywnego. Ostatecznie wariant z 7 mutacjami pozostałości został nazwany syntazą glikolaldehydu (GALS). Kcat GALS został poprawiony około 160-krotnie, a końcowa wydajność katalityczna GALS wynosi 9,6 m-1·s-1, co jest około 70-krotnie niż enzym wyjściowy (rys. 3a i dodatkowe rys. 7).
Inżynieria białek i analiza mechanizmu syntazy aldehydu glikolowego. parametry kinetyczne WT i mutantów. WT: Typ dziki; M1: mutacje w W86R i N87T; M2: mutacje w W86R, N87T, L109G i L110E; M3: mutacje w W86R, N87T, L109G, L110E i A460M; M4: mutacje w W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V i Q282F. B przegląd wybranych pięciu mutacji w ośrodku aktywnym. Ima: pośredni Analog; pomarańczowe linie wskazują wiązania wodorowe między grupą hydroksylową IMA a mutacją L110E., c Pojemność kieszeni M1, M2, M3 i M4. Różowe kropki reprezentują objętość oprawek (dane uzupełniające 2), które wynoszą odpowiednio 131,25, 161,50, 133,38 i 171,38 Å3. Dane zostały renderowane przy użyciu oprogramowania UCSF Chimera w wersji 1.1246. Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.
aby dowiedzieć się, w jaki sposób te mutacje poprawiają aktywność enzymu, zaproponowaliśmy ponowne krystalizację GALS. Aktywna kieszeń znajduje się na interfejsie homodimeru GALS38., Struktura białka GALS może różnić się od białka wyjściowego po kilku rundach mutacji. Tutaj skrystalizowaliśmy białko GALS i pobraliśmy strukturę krystaliczną GALS za pomocą struktury BFD jako modelu wyszukiwania (dodatkowa Tabela 3). Analizowano strukturę krystaliczną GALS (rys. 8, Dodatkowe Rys. 9). Odkryliśmy, że mutacja L110E wprowadza dwa dodatkowe wiązania wodorowe do grupy hydroksylowej pośredniego analogu( IMA), które mogą przyczynić się do stabilizacji stanu przejściowego i rozszczepienia wiązania C-C między produktem a kofaktorem ThDP (rys. 3b)., Mutacja L109G powiększyła objętość kieszeni wiążącej substrat, zastępując dużą grupę izobutylową grupą wodorową. Trzecia mutacja A460M może zmienić orientację podłoża, a następnie wzmocnić interakcję między ThDP a substratem. Dwie ostatnie mutacje H281V i Q282F rozszerzyły promień porów powierzchni zewnętrznej i mogą ułatwić dostęp do substratu lub produktu (rys. 3c). W porównaniu z M1 objętość kieszeni reakcji w GALS została powiększona o ponad 30%, co byłoby główną przyczyną poprawy aktywności katalitycznej.,
Identyfikacja syntazy Acetylo-fosforanowej
w przyrodzie nie stwierdzono, aby enzym osiągał syntezę AcP z aldehydu glikolowego. Fosfoketolazy (PKs) mogą wytwarzać AcP z fruktozo-6-fosforanu (F6P) lub ksylulozo-5-fosforanu (X5P)39. Zgodnie z mechanizmem katalitycznym PKs możliwe jest, że aldehyd glikolowy wchodzi w interakcje z ThDP, a następnie generuje 2-α, β-dihydroksyetylideno-ThDP (DHEThDP) (rys. 4a), który jest kluczowym pośrednikiem w formowaniu AcP z F6P lub X5P przez PKs. Aby potwierdzić naszą hipotezę, wybraliśmy ośmiu kandydatów (rys., 4b) na podstawie drzewa filogenetycznego PKs z 111 rodzin bakterii (rys. 10). Po syntezie genów i oczyszczaniu białek (rys. 11), zbadaliśmy aktywność katalityczną wszystkich kandydujących białek przy użyciu aldehydu glikolowego jako substratu. Na szczęście pięć z ośmiu PKs przejawiało znaczącą aktywność katalityczną. Jedynie PK1, PK4 i PK8 nie wykazywały znaczącej różnicy w stosunku do kontroli in blanco. Tak więc PK2 o najwyższej aktywności określano jako syntazę Acetylo-fosforanową (ACPS), której kcat / Km osiąga 3,21 m-1·s-1 (rys. 12).,
Analiza obliczeniowa i identyfikacja funkcjonalna syntazy Acetylo-fosforanowej. a powstawanie DHEThDP z F6P / X5P i aldehydu glikolowego. Strzałki stałe reprezentują mechanizm powstawania DHEThDP w ref. 39; przerywane strzałki wskazują przewidywany proces z wykorzystaniem aldehydu glikolowego jako substratu. b identyfikacja ACP. Maksimum prawdopodobieństwa drzewo filogenetyczne wybranych ośmiu PKs zostało skonstruowane przez MEGA47., Szczegóły dotyczące wybranych PKs znajdują się w nocie uzupełniającej i rys. uzupełniającym. 10. Aktywność każdego białka została wykryta przez dodanie 0,5 mg enzymu mL−1 i 10 mM aldehydu glikolowego. ACP acetylofosforan, fosfoketolaza PK, produkcja AcP (µmol min−1 mg-1): Ilość AcP wyprodukowana na mg enzymu na minutę; kontrola: w układzie reakcji nie dodano enzymu; paski błędów reprezentują s. d. (odchylenie standardowe), n = 3. c profil energetyczny procesu formowania DHEThDP., IM1 i IM2 reprezentują pośrednie 1 i 2 podczas procesu formowania; TIM reprezentuje tautomeryzowany pośrednik między IM1 i IM2; TS1 i TS2 reprezentują stany przejściowe. Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.
aby ujawnić mechanizm formowania DHEThDP z aldehydu glikolowego, zaproponowaliśmy przeprowadzenie analizy teoretycznej w oparciu o poprzedni model obliczeniowy PK40. Wszystkie możliwe aminokwasy związane z powstawaniem DHEThDP zostały użyte do skonstruowania modelu obliczeniowego(rys. 13)., Na podstawie symulacji obliczeniowej odkryliśmy, że bariera energetyczna wynosi tylko 11,36 kcal mol-1 do tworzenia IM1 (pośredni 1), gdy aldehyd glikolowy został protonowany przez His553, który został uznany za najbardziej możliwy donor protonu40 (rys. 4c). Następnie IM1 tautomeryzuje się do IM2 przy pomocy Glu479 i Glu437. IM2 jest energetycznie bardziej stabilny niż IM1. Gdy proton IM2 został pozbawiony przez N4′ w ThDP, bariera energetyczna od IM2 do kluczowego pośredniego DHEThDP wynosi 15.,13 kcal mol-1, co jest tak samo podobne jak energia szczepu podczas tworzenia DHEThDP przy użyciu F6P jako substratu40. Po utworzeniu DHEThDP następujące procesy katalityczne są takie same jak inne PKs(rys. H97 działa jako donor protonu w procesie dehydratacji DHEThDP, a His142 i Gly155 przyspieszają proces dehydratacji DHEThDP, sądząc po tym, że His142 i Gly155 tworzą wiązania wodorowe z cząsteczką wody w strukturze pośredniej po dehydratacji (AcThDP)., His64, Tyr501 i Asn549 są ważne dla nukleofilowego ataku Pi i razem tworzą miejsce wiązania Pi39. Badania mutagenezy ukierunkowane na miejsce wykazały również, że te pozostałości mają kluczowe znaczenie dla aktywności enzymu (rys. 15).
synteza acetylo-CoA z formaldehydu in vitro
dzięki początkowemu udanemu projektowi GALS i ACP, zamierzaliśmy skonstruować szlak SACA in vitro do syntezy acetylo-CoA z formaldehydu. Po pierwsze, zmierzyliśmy wydajność aldehydu glikolowego przez GALS w różnych stężeniach Formaldehydu., Wyniki wykazały, że GALS może skutecznie katalizować dimeryzację formaldehydu, a wydajność aldehydu glikolowego wzrosła wraz z poprawą stężenia substratu (rys. 5a). Na przykład wydajność aldehydu glikolowego z formaldehydu wzrosła z 45% przy 0,5 g L-1 do 80% przy 2 g L−1. Po drugie, zbadaliśmy sprawność katalityczną z aldehydu glikolowego do AcP, która została określona ilościowo na podstawie zawartości kwasu octowego, ponieważ AcP byłby szybko rozkładany do kwasu octowego(rys. 16)23., Wyniki wykazały, że plon AcP osiągnął ponad 80% w różnych stężeniach aldehydu glikolowego za pośrednictwem ACPS(dodatkowa rys. 17). Niestety ACPS był oczywiście hamowany przez formaldehyd (rys. 5b). Dlatego konieczne jest zrównoważenie stężenia formaldehydu w rozwiązaniu tego konfliktu.
potwierdzający biosyntezę acetylo-CoA z formaldehydu drogą SACA in vitro. a synteza aldehydu glikolowego z formaldehydu przez GALS., Reakcje przeprowadzono w różnych stężeniach formaldehydu z 2 mg mL−1 oczyszczonych GALS w 37 °C przez 2 h. b hamowanie ACPS przez formaldehyd. Wydajność kwasu octowego mierzono w różnych punktach czasowych za pomocą bufora reakcyjnego, 2 mg mL-1 ACPS, 0,75 g L-1 aldehydu glikolowego i gradientu Formaldehydu od 0 do 2 G L-1, który był reprezentowany przez różne linie kolorów. c Wydajność kwasu octowego z różnych stężeń Formaldehydu. Reakcje przeprowadzono w temperaturze 37 °C przez noc z buforem reakcyjnym, 2 mg ml−1 GALS, 2 mg mL−1 ACPS i gradientem Formaldehydu od 0.,5-2 g L-1. D wydajność kwasu octowego lub acetylo-CoA z 1 g Formaldehydu L−1. Wydajność kwasu octowego lub acetylo-CoA mierzono w różnych punktach czasowych. Niebieska linia reprezentuje układ reakcji do produkcji acetylo-CoA (z podawaniem 20 mM CoA i zawierającym odpowiednio 2 mg mL−1 oczyszczonych GALS, ACPS i PTA); linia pomarańczowa reprezentuje układ reakcji do produkcji kwasu octowego (zawierający 2 mg mL−1 GALS i ACPS i bez podawania Coa). Próbki we wszystkich testach były analizowane przez HPLC. Paski błędów reprezentują s. d. (odchylenie standardowe), n = 3., Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.
w celu optymalizacji stężenia formaldehydu przeprowadzono eksperyment gradientowy przy użyciu układu reakcji, który zawiera 2 mg mL−1 GALS i ACP. Wraz ze wzrostem stężenia formaldehydu wydajność kwasu octowego w układzie początkowo wzrosła, a następnie zmniejszyła się (rys. 5c). Gdy stężenie formaldehydu wynosi 1 g L-1, Wydajność kwasu octowego osiągnęła 50,6%., Co ciekawe, końcowy uzysk kwasu octowego jest nawet wyższy niż w układzie reakcji z aldehydu glikolowego do AcP z taką samą ilością Formaldehydu (rys. 5B, szara linia). Spowodowałoby to częściowe zwolnienie funkcji ACP, ponieważ formaldehyd był stopniowo konsumowany przez dziewczęta. W oparciu o ten system dodaliśmy jeszcze inny znany enzym acetylotransferazę fosforanową (PTA), który przekształciłby AcP w acetylo-CoA. Ostatecznie szlak SACA wytworzył 5,5 mM acetylo-CoA w stężeniu Formaldehydu 1 g L-1. Wydajność acetylo-CoA z formaldehydu wynosiła około 33% (rys. 5d)., Jednak wydajność kwasu octowego (7,8 mM) z formaldehydu (33,3 mM) osiągnęła 50%, jeśli PTA i CoA nie zostały dostarczone. Niższa wydajność acetylo-CoA niż kwasu octowego byłaby spowodowana niestabilnością acetylo – CoA i AcP. Nasze wyniki wykazały, że jest on skuteczny w biosyntezie acetylo-CoA z formaldehydu drogą saca in vitro.,
Walidacja szlaku SACA za pomocą znakowania 13C
Po ustaleniu szlaku SACA za pomocą oczyszczonych enzymów in vitro, próbowaliśmy dalej przetestować biosyntezę acetylo-CoA i jego pochodne ze szlaku SACA in vivo za pomocą testów znakowania metabolicznego 13C (ryc. 6a). Po pierwsze, lizaty komórkowe zostały użyte do weryfikacji biosyntezy acetylo-CoA przez dodanie Formaldehydu znakowanego 13C i COA. Wykryliśmy znaczny wzrost podwójnego acetylo-CoA znakowanego 13C niż inne kontrolki (wartość P < 0.001, test T) (rys. 6b i dodatkowe rys. 18)., Ponadto wzrost podwójnego acetylo-CoA znakowanego 13C zniknął, jeśli pominiemy jeden z genów w szlaku SACA, takich jak ACPS i PTA (dodatkowe rys. 19). Ponadto acetylo-CoA byłby zbieżny z szczawiooctanem, aby wejść w cykl kwasu trikarboksylowego (TCA). Wykryliśmy również znacznie więcej podwójnych fumaranów znakowanych 13C (wartość P < 0.001, t-test) i jabłczanów (wartość p < 0.001, t-test) tylko w szczepie ze szlakiem SACA i podawaniem Formaldehydu znakowanego 13C (rys. 6b i dodatkowe rys. 18)., Nie wykryliśmy jednak znaczących różnic w izotopomerach o masie wyższego rzędu. Byłoby to spowodowane niską ilością podwójnych izotopomerów znakowanych 13C w cyklu TCA.
13C-znakowana analiza szlaku metabolicznego SACA. schemat badanego szlaku dla znacznika znakowanego 13C. B frakcja związków m + 2 w lizatach komórkowych z formaldehydem znakowanym 13C lub nieoznakowanym. C frakcja metabolitów znakowanych 13C., Komórki były indukowane w LB i przenoszone do pożywki M9 zawierającej metanol znakowany 13C. Metabolity wewnątrzkomórkowe wykrywano po 16 h inkubacji, a aminokwasy białkowe mierzono po 26 h inkubacji. Suma wykrytych izotopomerów została ustalona na 100%., Formaldehyd znakowany 13C, M + 0 bez znakowania 13C, M + 1 pojedyncze znakowanie 13C, m + 2 podwójne znakowanie 13C, formaldehyd FALD, metanol MeOH, aldehyd glikolowy Gald, Acetylo-fosforan AcP, Asp asparaginian Glu, fosfoenolopirogronian PEP, SACA szczep zawiera wektor GALS-ACPS-PTA-28a, 28A szczep zawiera pusty wektor 28A, BsMDH-saca szczep zawiera zarówno wektory BSMDH-PCDF jak i gals-ACPS-PTA-28A, BSMDH-28A: szczep zawiera zarówno Wektor bsmdh-PCDF jak i Wektor pusty 28A. paski błędów reprezentują S.D. (odchylenie standardowe), N = 3., Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.
następnie zaproponowaliśmy przetestowanie przepływu węgla w komórkach. Ze względu na toksyczność Formaldehydu dla komórek, wprowadziliśmy dehydrogenazę metanolu z Bacillus stearothermophilus (bsmdh)41, aby utrzymać stale niskie stężenie formaldehydu in vivo (rys. 6a). Hodowane komórki były zbierane w różnych punktach czasowych i były wykorzystywane do wykrywania aminokwasów białkowych i metabolitów wewnątrzkomórkowych (rys. 6c)., Odkryliśmy, że szczep ze szlakiem SACA (BsMDH-SACA) zawierał więcej podwójnych asparaginianów i glutaminianów znakowanych 13C, które pochodzą z cyklu TCA. Ponadto glukoza i fosfoenolopirogronian znakowane 13C, które mogą wytwarzać z podwójnego szczawiooctanu znakowanego 13C poprzez szlak glukoneogenezy, zostały wykryte bardziej w szczepie BSMDH-SACA niż w szczepie kontrolnym (BsMDH-28a). Tak więc nasze wyniki wykazały, że szlak SACA jest funkcjonalny do wytwarzania metabolitów acetylo-CoA i acetylo-CoA z formaldehydu.,
ocena szlaku SACA przez wzrost komórek
w celu dalszej oceny szlaku SACA in vivo, zaproponowaliśmy testowanie wzrostu komórek krok po kroku przez karmienie każdego pośrednika w szlaku. Początkowo E. coli dorastał pod bogatym pożywką, a następnie dodano aldehyd glikolowy jako dodatkowe źródło węgla. Poprzez dodanie różnych stężeń aldehydu glikolowego (rys. 20), okazało się, że zmodyfikowany szczep, który zawiera szlak SACA z więcej niż 0.,4 G L−1 podaż aldehydu glikolowego ma niezwykłą wyższą OD600 niż te szczepy bez aldehydu glikolowego lub szlaku SACA(rys. 7a oraz dodatkowe rys. 21). Udział aldehydu glikolowego w biomasie (komórkowa sucha masa, CDW) wynosił 0,681 ± 0,028 gcdwg-1 (n = 3) aldehydu glikolowego.
testuje wzrost komórek przy użyciu 0,4 g L−1 glycolaldehydu jako uzupełniającego źródła węgla., testy wzrostu komórek b z wykorzystaniem 80 mg Formaldehydu L−1 jako uzupełniającego źródła węgla. testy wzrostu komórek c z wykorzystaniem 8 g L−1 metanolu jako dodatkowego źródła węgla. Komórki początkowo hodowano w pożywce LB. IPTG dodano w celu wywołania ekspresji białka, a następnie dodano dodatkowe źródła węgla. OD600 został wykryty w różnych punktach czasowych., SACA szczep zawiera wektor GALS-ACPS-PTA-28a, 28A szczep zawiera pusty wektor 28A, BsMDH-SACA szczep zawiera zarówno wektory bsmdh-pCDF jak i GALS-ACPS-PTA-28A, bsmdh-28a szczep zawiera zarówno wektor bsmdh-pCDF jak i pusty wektor 28a, No GALS szczep zawiera wszystkie geny w szlaku oprócz GALS, + dodanie dodatkowego źródła węgla, − bez dodatkowego źródła węgla, aldehyd glikolowy (gald), formaldehyd (fald), metanol (meoh). Paski błędów reprezentują s. d. (odchylenie standardowe), n = 3. Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.,
Kiedy testowaliśmy wzrost komórek przy użyciu Formaldehydu jako dodatkowego źródła węgla, wzrost szczepu z pustym wektorem został całkowicie zahamowany przez 80 mg L−1 Formaldehydu (rys. 7b). Szczep zawierający szlak SACA był początkowo hamowany, a następnie dorastał normalnie w tym samym stanie, co może być spowodowane szybszym tempem zużycia Formaldehydu niż szczep z pustym wektorem(rys. 22)., Niestety szczep zawierający szlak SACA nie miał więcej biomasy z dodatkiem Formaldehydu niż te bez formaldehydu. Wyniki te wykazały, że chociaż szlak SACA jest bardziej skuteczny w usuwaniu toksycznego formaldehydu, nie wystarczy dostarczyć biomasy.
w końcu zamierzaliśmy ocenić szlak SACA poprzez podawanie metanolu, który byłby stale przekształcany w formaldehyd. Odkryliśmy, że szczep zawierający zarówno szlak bsmdh, jak i Szlak SACA ma wyższy OD600 niż te kontrole bez zasilania metanolem lub szlak SACA (rys. 7c i dodatkowe rys., 23). Po 26 h inkubacji okazało się, że wartość OD600 w szczepie zawierającym zarówno szlak BsMDH, jak i Szlak SACA wzrosła o około 0,2, co jest znacznie wyższe niż szczep bez szlaku SACA (wartość p = 0,005, test T). Porównując ze szczepem bez szlaku SACA, odkryliśmy, że ilość biomasy pochodzącej z metanolu wynosiła 0,03 ± 0,006 gcdw G-1 (n = 3) metanolu w szczepie zawierającym szlak SACA.