De oxidasetest detecteert de aanwezigheid van een cytochroom – oxidasesysteem dat het transport van elektronen tussen elektronendonors in de bacteriën en een redoxkleurstof-tetramethyl-p-fenyleen-diamine katalyseert. De kleurstof is gereduceerd tot dieppaarse kleur., Deze test wordt gebruikt voor de identificatie van Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella en Pasteurella, die allemaal het enzym cytochroomoxidase produceren.
voor deze test kunnen een aantal reagentia worden gebruikt.,
- Kovacs Oxidase Reagent:
1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water
- Gordon and McLeod’s Reagent:
1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water
- Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:
1% α-naphthol in 95% ethanol
1% p-aminodimethylaniline HCL
Principle of Oxidase Test
Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismen die cytochroom c als onderdeel van hun ademhalingsketen bevatten, zijn oxidase-positief en maken het reagens blauw/paars. Organismen zonder cytochroom c als onderdeel van hun ademhalingsketen oxideren het reagens niet, waardoor het binnen de grenzen van de test kleurloos blijft, en zijn oxidase-negatief.
Oxidase-positieve bacteriën bezitten cytochroom-oxidase of indofenol-oxidase (een ijzer dat hemoproteïne bevat). Beide katalyseren het transport van elektronen van donorsamenstellingen (NADH) aan elektronenacceptoren (gewoonlijk zuurstof)., Het testreagens, N, N, N’, N’-tetramethyl-p-fenyleendiaminedihydrochloride werkt als een kunstmatige elektronenacceptor voor het enzym oxidase. Het geoxideerde reagens vormt de gekleurde verbinding indofenolblauw.
het cytochroomsysteem is gewoonlijk alleen aanwezig in aërobe organismen die in staat zijn om zuurstof als uiteindelijke waterstofreceptor te gebruiken. Het eindproduct van dit metabolisme is water of waterstofperoxide (afgebroken door catalase).
doel / gebruik van de Oxidasetest
- De oxidasetest wordt gebruikt om te bepalen of een organisme het cytochroom-oxidase-enzym bezit.,
- de test wordt gebruikt als hulpmiddel voor de differentiatie van de soorten Neisseria, Moraxella, Campylobacter en Pasteurella (oxidase-positief).
- het wordt ook gebruikt om pseudomonaden te onderscheiden van verwante soorten.
procedure van de Oxidasetest
Er zijn veel variaties in de methode bij de oxidasetest. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de filterpapiertest, directe plaatmethode, swabmethode, geïmpregneerde oxidaseteststripmethode en reageerbuismethode. Alle tijden en concentraties zijn gebaseerd op de oorspronkelijke aanbevelingen.,
droge Filterpapiermethode
aangezien het oxidasereagens instabiel is en vers voor gebruik moet worden bereid, is deze methode handig.
- Strip van Whatman ‘ s Nr. 1 filtreerpapier wordt gedrenkt in een vers bereide 1%-oplossing van tertramethyl-p-fenyleen-diaminedihydrochloride.
- na ongeveer 30 seconden uitlekken worden de stroken gevriesdroogd en bewaard in een donker flesje dat goed is afgesloten met een schroefdop.
- voor gebruik wordt een strip verwijderd, in een petrischaal gelegd en bevochtigd met gedestilleerd water.,
- de te testen kolonie wordt opgepikt met een platina lus en over het vochtige gebied uitgesmeerd.
- een positieve reactie wordt aangegeven door een intense dieppaarse tint, die binnen 5-10 seconden verschijnt, een “vertraagde positieve” reactie door kleuring binnen 10-60 seconden, en een negatieve reactie door afwezigheid van kleuring of door kleuring na 60 seconden.
natte Filterpapiermethode
- een strook filterpapier wordt gedrenkt met een weinig vers gemaakte 1% – oplossing van het reagens.
- Er wordt een stukje cultuur op gewreven met een platina lus.,
- een positieve reactie wordt aangegeven door een intense dieppaarse tint, die binnen 5-10 seconden verschijnt, een “vertraagde positieve” reactie door kleuring binnen 10-60 seconden, en een negatieve reactie door afwezigheid van kleuring of door kleuring na 60 seconden.
directe plaatmethode
- voeg 2 -3 druppels reagens rechtstreeks toe aan verdachte kolonies op een agarplaat. Vul de plaat niet met het reagens.
- observeren voor kleurverandering binnen 10 Seconden.
opmerking: de directe plaatmethode moet worden uitgevoerd op een niet-selectieve agarplaat.,
- bij gebruik van Kovac ‘ s oxidasereagens zijn micro-organismen oxidase-positief wanneer de kleur binnen 5 tot 10 Seconden donkerpaars wordt. Micro-organismen worden vertraagd oxidase positief wanneer de kleur verandert in paars binnen 60 tot 90 seconden. Micro-organismen zijn oxidase negatief als de kleur niet verandert of het langer duurt dan 2 minuten.
- bij gebruik van Gordon-en McLeod-reagens zijn micro-organismen oxidase-positief wanneer de kleur binnen 10 tot 30 minuten in rood of binnen 60 minuten in zwart verandert. Micro-organismen zijn oxidase negatief als de kleur niet verandert.,
Swab Method
- Dompel het swab in het reagens en raak vervolgens een geïsoleerde verdachte kolonie aan
- observeer kleurverandering binnen 10 Seconden.
Testbuismethode
- laat een verse cultuur (18 tot 24 uur) van bacteriën groeien in 4,5 ml nutriëntenbouillon (of standaardmedia die geen hoge concentratie suiker bevatten).
- voeg 0,2 ml van 1% α-naftol toe en voeg vervolgens 0,3 ml van 1% p-aminodimethylanilineoxalaat (Gaby-en Hadley-reagentia) toe.
- krachtig schudden om te zorgen voor menging en grondige oxygenatie van de cultuur.,
- observeren voor kleurveranderingen.
- micro-organismen zijn oxidase-positief wanneer de kleur binnen 15 tot 30 seconden in blauw verandert. Micro-organismen worden vertraagd oxidase positief wanneer de kleur verandert in paars binnen 2 tot 3 minuten. Micro-organismen zijn oxidase negatief als de kleur niet verandert.
resultaat interpretatie van de Oxidasetest
positief resultaat
ontwikkeling van een dieppaars-blauwe / blauwe kleur duidt op oxidaseproductie binnen 5-10 seconden.
negatief resultaat
geen paars-blauwe kleur/geen kleurverandering.,
Examples
Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.
Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)
kwaliteitscontrole voor Oxidase Test
Positieve Controle: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Negatieve Controle: Escherichia coli ATCC 25922
Beperkingen van Oxidase Test
- De gebruikte reagentia in de oxidase test zijn weergegeven op auto-oxideren, dus het is zeer belangrijk om verse reagentia, niet ouder dan 1 week.
- zowel bacteriën als gist die worden geteeld op media met hoge glucoseconcentraties vertonen een geremde oxidaseactiviteit; daarom wordt aanbevolen om kolonies te testen die worden geteeld op media zonder overmaat aan suiker, zoals voedingsagar., Tryptische soja agar is ook een uitstekende media.
- bacteriën gekweekt op media die kleurstoffen bevatten, kunnen afwijkende resultaten geven.
- de testreagentia zullen de micro-organismen effectief doden, zodat subculturering moet plaatsvinden voordat een reagens aan een actieve cultuur wordt toegevoegd.
- de oxidasetest kan worden gebruikt voor de vermoedelijke identificatie van Neisseria en voor de differentiatie en identificatie van gramnegatieve bacillen. Oxidase-positieve organismen moeten worden onderzocht met gramkleuring om de morfologie en gramreactie te bepalen., Aanvullende biochemische tests worden aanbevolen voor volledige identificatie.
- het gebruik van een nichroom of een andere ijzerhoudende lus kan vals-positieve reacties opleveren. Platinum loops worden aanbevolen.
- de meeste Haemophilus zijn oxidase-positief. Minder gevoelige strips of reagentia kunnen vals-negatieve resultaten opleveren.
- Oxidasereacties van gramnegatieve bacillen dienen te worden bepaald op niet-selectieve en niet-differentiële media om geldige resultaten te garanderen. Ook, kolonies genomen uit media die hoge niveaus van glucose bevatten kunnen vals-negatieve reacties geven.,
- het wordt aanbevolen om kolonies te gebruiken die 18-24 uur oud zijn. Oudere kolonies zullen zwakkere reacties veroorzaken.
- kleurveranderingen die na 20 seconden optreden, moeten buiten beschouwing worden gelaten.