Next generation sequencing (NGS) methoden begonnen in de literatuur te verschijnen in het midden van de jaren 2000 en hadden een transformerend effect op ons begrip van microbiële genomica en infectieziekten. Er is niettemin aanzienlijke controverse over hoe, wanneer, en waar volgende generatie het rangschikken een rol zal spelen in het klinisch diagnostisch laboratorium., Een diepe duik punt-contrapunt discussie van het Journal of Clinical Microbiology bespreekt de uitdagingen en kansen die kunnen komen met de introductie van metagenomic next generation sequencing (mNGS) in routine laboratoria. Wat is mNGS precies en hoe verschilt het van de vele andere nucleïnezuurtechnologieën die er zijn?

Wat is metagenomic Next Generation Sequencing?

het volgende generatie rangschikken is om het even welke van verscheidene hoog-productie rangschikkende methodes waarbij miljarden nucleïnezuurfragmenten gelijktijdig en onafhankelijk kunnen worden gerangschikt., Contrast deze techniek aan klassieke die methodes zoals sanger rangschikken (ook als het beëindigen van de dideoxynucleotideketen rangschikken wordt bekend), die één nucleotideopeenvolging per reactie verwerkt.
Om een bacterieel genoom te karakteriseren met behulp van NGS, bijvoorbeeld, wordt het genoom gesplitst in meerdere fragmenten die sequenties produceren of lezen die zich uitstrekken van honderden tot tienduizenden basissen in lengte. De opeenvolgingen worden geassembleerd in één enkel genoom gebruikend computationele benaderingen. Verscheidene overlappende opeenvolgingslezingen worden samengevoegd om één enkele langere opeenvolging te produceren die contig wordt genoemd., Er zijn vaak hiaten tussen contigs en hoewel high-fidelity langere sequentie leest zou de ideale methode voor het rangschikken, platforms die kortere leest produceren zijn over het algemeen minder duur en de overlapping in sequenties maakt ze nauwkeuriger. Het geconstrueerde genoom (waarschijnlijk met hiaten) wordt afgestemd op een referentiedatabase voor identificatie van het organisme. Deze technologie vertegenwoordigt een wezenlijke vooruitgang over de vroege dagen van het rangschikken wanneer één enkel bacterieel genoomproject verscheidene jaren kon vergen.,
Metagenomic NGS (mNGS) draait eenvoudig alle nucleïnezuren in een steekproef, die gemengde populaties van micro-organismen kunnen bevatten, en wijst deze toe aan hun referentie genomen om te begrijpen welke microben aanwezig zijn en in welke verhoudingen. De capaciteit om nucleic zuren van veelvoudige verschillende taxa voor metagenomic analyse te rangschikken en te identificeren maakt dit een krachtig nieuw platform dat genetisch materiaal van geheel verschillende koninkrijken van organismen gelijktijdig kan identificeren.,de mogelijke klinische toepassingen zijn enorm, waaronder de diagnose van infectieziekten, het volgen van uitbraken, toezicht op infectiebeheersing en de ontdekking van mutaties en pathogenen, onder vele anderen. mNGS, soms genoemd Jachtgeweer rangschikken, van klinische steekproeven is toegepast op diverse steekproeftypes met inbegrip van cerebrospinale vloeistof, bloed, ademhalingsteekproeven, gastro-intestinale vloeistof, en oculaire vloeistof.

Wat zijn de voordelen van metagenomic Next Generation Sequencing?,

de grootste sterkte van mNGS is dat het een onbevooroordeelde hypothese-vrije diagnostische methode is, in tegenstelling tot gerichte polymerasekettingreactiemethoden (PCR) die gebaseerd zijn op primers voor de identificatie van specifieke doelen die moeten worden versterkt en gedetecteerd. Zelfs de Universele of breed-waaier PCR methodes zijn niet voldoende breed om metagenomic te worden beschouwd, aangezien zij specifieke primers van behouden 16S ribosomal gen van RNA (rRNA) en interne getranscribeerd spacer (zijn) opeenvolgingen gebruiken om onderscheidende nucleic zure opeenvolgingen te versterken die bioinformatically in bacteriën/archaea, of respectievelijk schimmels kunnen worden geclassificeerd., Universele primers vormen ook een probleem bij het diagnosticeren van polymicrobiële infecties met moleculaire tests. Als de polymicrobial populaties aanwezig zijn wanneer het gebruiken van 16S het rangschikken, zullen de veelvoudige base-calls per nucleotide worden gemaakt, producerend een gemengd nucleotidechromatogram dat niet kan worden geïnterpreteerd. Terwijl er de-convolutionele computationele methodes beschikbaar zijn om geà dentificeerde organismen te voorspellen, zijn deze niet in standaardgebruik voor vele laboratoria, die vaak aan volgende-generatie het rangschikken van het 16S gen voor polymicrobial steekproeven reflexeren.,

Wat zijn de uitdagingen van metagenomic Next Generation Sequencing?

ondanks het potentieel van MNG ‘ s, zijn er veel obstakels die moeten worden verwijderd voordat de technologie deel kan gaan uitmaken van het mainstream laboratorium, evenals hiaten in onze kennis over het diagnostische nut ervan. Belangrijke bezwaren zijn onder meer de interpretatie van bevindingen (het onderscheiden van besmetting en kolonisatie van echte pathogenen), selectie en validatie van databases die worden gebruikt voor analyses, en voorspelling (of het ontbreken daarvan) van antimicrobiële gevoeligheden., Een gemeenschappelijke perceptie is dat mNGS is zo ongelooflijk gevoelig dat het een diagnose zal onthullen wanneer alle andere testen negatief is. Terwijl mNGS analytisch gevoeliger kan zijn dan standaard kweekmethoden in sommige gevallen, kan de noodzakelijke verwijdering van enorme hoeveelheden menselijk nucleic zuur tijdens het rangschikken van voorbereiding en (door computationele methoden) tijdens het post-analytisch proces, de gevoeligheid in vergelijking met gerichte PCR-benaderingen voor vele organismen verminderen. de specificiteit van mNGS blijft de spreekwoordelijke olifant in de kamer., Contaminatie van monsters tijdens de monsterverzameling is een grote zorg gezien de toegenomen analytische gevoeligheid van MNG ‘ s in vergelijking met standaardkweekmethoden, en er moet een gevalideerd kwaliteitscontroleproces zijn voor stappen van het beoordelen van de reagenszuiverheid tot het meten van adequate controles van de genoomdekking. Bovendien, met sommige Illumina platforms, de verkeerde barcode indices kunnen worden aangewezen, wat leidt tot valse positieven op het rangschikken van gegevens., Bioinformatische kwaliteitscontroles zijn nodig om ervoor te zorgen dat hoge kwaliteit en gevalideerde genomen beschikbaar zijn met minimale database fouten en er zou idealiter bioinformatisch personeel beschikbaar zijn om sequencing resultaten te interpreteren voor elke test, die niet beschikbaar is in de meeste klinische microbiologische laboratoria., De Federal Drug Administration (FDA) heeft samengewerkt met andere federale instanties om een database genaamd FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), die nuttig is geweest om ervoor te zorgen dat de huidige mngs resultaten betrouwbaar en accuraat zijn, maar deze middelen moeten worden bijgewerkt en onderhouden. de grotere vraag blijft over de klinische specificiteit van MNG ‘ s: zijn de gedetecteerde sequenties van pathogenen die bijdragen aan de huidige ziekte van de patiënt?, De analytische specificiteit van het testen van mNGS kan met strenge controles door specimeninzameling worden aangepakt, het rangschikken bibliotheekvoorbereiding, assay looppas, en bioinformatische classificatie, maar de klinische specificiteit wordt niet direct aangepakt door deze benaderingen. Vragen die kunnen helpen bij het bepalen van de klinische bruikbaarheid en toepasbaarheid zijn onder meer: Hoe kunnen we organismen met betrekking tot voorbijgaande bacteriëmie onderscheiden van orale/gastro-intestinale flora of huidkolonizers in bloed/plasma mngs testen?, Hoe moet sequentiediepte worden gerapporteerd en hoe betrouwbaar is de relatie tussen sequentiediepte en echte infectie? Verschilt deze relatie per pathogeen / gastheer? Hoe lang is de verwachte detecteerbare halfwaardetijd van een pathogeen door mNGS zodra de patiënt een geschikte curatieve therapie krijgt? Studies over klinisch nut en kosteneffectiviteit zijn sterk nodig ondanks de onbetwistbare kracht van deze technologie vanuit een onderzoek en ontdekking perspectief., het is ook de moeite waard erop te wijzen dat er momenteel geen door de FDA goedgekeurde of goedgekeurde mngs-tests zijn die voor microbiële tests kunnen worden verzonden, hoewel er laboratoria zijn gecertificeerd in het kader van de Clinical Laboratory Improvement Amendments van 1988 (CLIA ’88) die testen op klinische monsters aanbieden. Tot op heden zijn slechts enkele diagnostische NGS-systemen door de FDA goedgekeurd voor bijvoorbeeld oncologische testen of detectie van cystische fibrose., Een recente herziening beschrijft in detail veel van de regelgevende hindernissen en overwegingen die moeten worden aangepakt voordat MNG ‘ s kunnen toetreden tot de reguliere klinische diagnostische laboratoria als een FDA-gevalideerde test.
samengevat, hoewel het testen van mNGS waarschijnlijk een belangrijke rol zal spelen in de microbiologische diagnostische workflow in de toekomst, met name als sequencing en bioinformatische verwerkingskracht evolueert, blijft dit een zeer complexe technologie waarvoor het klinische nut in onze huidige medische praktijkomgeving onzeker blijft., Hoewel het testen van mNGS nieuwe en opwindende diagnostische klinische kansen in de nabije toekomst kan bieden, zal geen van deze waarschijnlijk binnenkort een scherpzinnige clinicus vervangen. het bovenstaande geeft de mening van de auteur weer en komt niet noodzakelijk overeen met de mening van de American Society for Microbiology.