na zijn studie aan de RADA van 1992 tot 1995, werd Macfadyen vooral bekend in het Britse theater voor zijn werk met het toneelgezelschap Cheek van Jowl, waarvoor hij Antonio speelde in the Duchess of Malfi, Charles Surface in the School for Scandal en Benedick in Much Ado About Nothing. Zijn Benedick werd gespeeld als een officier-klasse hansworst met een snor en een balkende lach. In 2005, Hij speelde Prins Hal in Henry IV, Parts One and Two in het Royal National Theatre, met Michael Gambon in de rol van Falstaff., In 2007, Hij keerde terug naar het podium, uitbeelden van een Amerikaan, Clay, een stay-at-home vader met een liberale houding in het toneelstuk The Pain and the Itch.
een TV-doorbraak kwam toen hij verscheen als Hareton Earnshaw in een bewerking van Wuthering Heights, vertoond op het ITV-netwerk in 1998. Verder televisiedramawerk volgde, waaronder hoofdrollen in the dramas Warriors (1999) en The Way We Live Now (2001), beide voor de BBC. Ook in 2001, hij verdiende bijval voor zijn hoofdrol in de BBC twee drama serie Perfect Strangers, die werd geschreven en geregisseerd door Stephen Poliakoff., In 2002, hij speelde in het Project, een BBC drama in kaart brengen van New Labour ‘ s rise to power. Hij speelde in Spooks, die een succes werd toen vertoond op BBC One. Een langer tweede seizoen werd vertoond in 2003, en een derde seizoen werd uitgezonden in de herfst van 2004, met hem verlaten van de serie in de tweede aflevering. De serie werd uitgezonden als MI-5 op het A&E netwerk. In 2007 verscheen hij in de one-off Channel 4 drama Secret Life, die ging over het controversiële onderwerp van pedofilie., Macfadyen won de Best Actor award op de Royal Television Society 2007 Awards voor dit deel, en werd genomineerd voor een BAFTA. Hij verscheen ook in een korte sketch voor Comic Relief als de bruidegom in Mr. Bean ‘ s Wedding, samen met Rowan Atkinson en Michelle Ryan.
buste van Mr.Darcy gespeeld door Matthew Macfadyen in Pride & Prejudice (2005 film)
Macfadyen verscheen in films als Enigma (uitgebracht in 2001), en In My Father ‘ s Den, waarvoor hij ontving de New Zealand Screen Award voor beste acteur., Hij starred als de romantische lead Fitzwilliam Darcy in een aanpassing van Pride and Prejudice, uitgebracht in het Verenigd Koninkrijk in September 2005.Macfadyen speelde in Frank Oz ’s Death at a Funeral en de film Incendiary, gebaseerd op Chris Cleave’ s roman samen met Michelle Williams en Ewan McGregor. Hij verscheen ook in Ron Howard ‘ s film Frost / Nixon, waarin hij speelde John Birt. In 2008 speelde hij de mannelijke hoofdrol Arthur Clennam in de BBC-bewerking van Charles Dickens’ Little Dorrit., In 2009 Macfadyen verscheen samen met Academy Award-genomineerde actrice Helena Bonham Carter in de BBC Four film Enid, gebaseerd op het leven van Enid Blyton, als Hugh Pollock, blytons uitgever en eerste echtgenoot.in 2010 speelde hij de rol van Sheriff of Nottingham in Robin Hood. Hij speelde Prior Philip in de tv-serie The Pillars of the Earth, en was de middelbare leeftijd Logan Mountstuart in Any Human Heart. In juni 2010, Macfadyen won een British Academy Television Award voor Beste Mannelijke Bijrol voor zijn werk in Criminal Justice.,in 2011 maakte Macfadyen een laatste cameo in de BBC-show Spooks, en in 2012 speelde hij Oblonsky in Joe Wrights film Anna Karenina. In december 2012 begon hij de rol van Detective Inspector Edmund Reid in BBC One ‘ S Ripper Street.in 2013-14 speelde hij Jeeves in de productie van Jeeves en Wooster in Perfect Nonsense in het Duke of York ‘ s Theatre in het West End van Londen. Het stuk won de 2014 Olivier award voor beste nieuwe komedie.in 2015 nam Amazon Prime Ripper Street op en, na goede recensies, werd het opnieuw in gebruik genomen voor het vierde en vijfde seizoen., Macfadyen zei dat hij was “blij om te beginnen aan een nieuwe dosis Ripper Street-bloed en ingewanden, Zakhorloges en Victoriaanse hoofddeksels, heerlijk donkere, ontroerende en mysterieuze verhaallijnen van de heer Richard Wardlow”. De serie werd ook uitgezonden in de Verenigde Staten op BBC America. Ook in 2015, hij gast starred in de pilot aflevering van The Last Kingdom.hij speelt momenteel als Tom Wambsgans in de HBO serie Succession, waarvoor hij een Primetime Emmy Award nominatie ontving.,in 2020 speelde hij de rol van majoor Charles Ingram in een driedelig iTV-drama, Quiz, gebaseerd op het controversiële hoesten cheat schandaal over Who Wants To Be A Millionaire in 2001.