de genetische verbindingen tussen DNA-herstelwegen en menselijke aanleg voor kanker hebben de interesse in de eiwitten aangewakkerd die specifieke plaatsen van DNA-schade herkennen en herstellen. De reparatieenzymen zijn opmerkelijk behouden van bacteriën aan schimmels aan mensen, die de premie onderstrepen geplaatst op het handhaven van genomic integriteit in het gezicht van een mutagene Last., DNA is vatbaar voor schade veroorzaakt door fouten begaan tijdens replicatie en door omgevingsfactoren, zoals straling, oxidanten of alkylerende stoffen. De reparatiereacties impliceren de uitsnijding van chemisch veranderde of mispaired basissen van de duplex van DNA. De resulterende hiaten worden ingevuld door de polymerasen van DNA; deze reactie laat een inkeping bij of flankerend de plaats van reparatie achter. Een analoog proces vindt plaats tijdens chromosomale DNA-replicatie, waarbij de 5 ‘ – RNA-segmenten die de eerste discontinue synthese van Okazaki-fragmenten vormen, worden uitgesneden, en de tussenliggende hiaten worden opgevuld door DNA-polymerase.,

de DNA-herstel – en replicatieroutes komen samen op een gemeenschappelijke laatste stap waarbij de continuïteit van de gerepareerde DNA-streng wordt hersteld door DNA-ligase, een enzym dat nicks omzet in fosfodiësterbindingen. Inkepingen zijn potentieel schadelijke DNA-laesies die, indien niet gecorrigeerd, kunnen leiden tot dodelijke dubbelstrengbreuken. Dienovereenkomstig, is het totale verlies van de ligasefunctie van DNA dodelijk.

DNA-Ligasereactie

DNA-ligases katalyseren de verbinding van een 5′-fosfaatgetermineerde streng met een 3′-hydroxylgetermineerde streng., Ligatie is afhankelijk van magnesium en een hoog-energetische cofactor, ofwel ATP of NAD+. Het reactiemechanisme impliceert 3 opeenvolgende nucleotidyloverdrachtreacties. In de eerste stap, nucleofiele aanval op de Alfa-fosfor van ATP (adenosine trifosfaat) of NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide) door ligase resulteert in afgifte van pyrofosfaat of NMN (nicotinamide mononucleotide) en vorming van een covalente intermediair (ligase-adenylaat) waarin AMP via een fosfoamide (P-N) binding aan de Epsilon-aminogroep van een lysine., In de tweede stap, wordt het AMP overgebracht aan het 5′-eind van de 5′-fosfaat-beëindigde bundel van DNA om DNA-adenylate — een omgekeerde structuur van de pyrofosfaatbrug, AppN te vormen. In deze reactie, valt de 5′-fosfaatzuurstof van de bundel van DNA fosfor van ligase-adenylaat aan; de actief-plaats lysine zijketen is de verliezende groep. In de derde stap, katalyseert ligase aanval door 3′-OH van de nick op DNA-adenylate om de 2 polynucleotides aan te sluiten en AMP te bevrijden.

fylogenetische distributie

levende organismen omvatten 3 domeinen: eubacteriën, archaeabacteriën en eukaryoten., Alle organismen coderen 1 of meer DNA-ligasen. De ligases worden gegroepeerd in 2 families, ATP-afhankelijke ligases en nad + – afhankelijke ligases, volgens het nucleotidesubstraat dat Voor ligase-adenylate vorming wordt vereist. ATP-afhankelijke ligases van DNA worden gevonden in alle 3 domeinen. Nad + – afhankelijke ligases van DNA (LigA) zijn alomtegenwoordig in bacteriën, waar zij voor de groei essentieel zijn en aantrekkelijke doelstellingen voor anti-infective drugontdekking presenteren. Nad+-afhankelijke ligasen worden slechts sporadisch aangetroffen buiten het bacteriële domein van het leven, bijv.,, in halophilic archaea en bepaalde virussen van DNA, en werden vermoedelijk verworven in deze taxa door horizontale genoverdracht.

eukaryotische cellulaire ATP-afhankelijke ligasen

ATP-afhankelijke DNA ligasen worden gevonden in alle eukaryotische soorten. Zoogdiercellen bevatten vier ligase isozymen van DNA. Aminozuur-opeenvolgingsvergelijkingen stellen voor dat een katalytisch kerndomein gemeenschappelijk aan alle ATP-afhankelijke ligases door extra isozyme-specifieke domeinen wordt verfraaid die bij de amino of carboxyltermini van de proteã nen worden gevestigd., Men denkt dat deze flankerende segmenten de band van ligases van zoogdierdna aan andere proteã NEN bemiddelen betrokken bij de replicatie, de reparatie, en de nieuwe combinatie van DNA. De zoogdierisozymes worden bedoeld als ligase I, ligase IIIa, ligase IIIb, en ligase IV. ligase I van DNA is een 919-aminozuurpolypeptide, uitgedrukt in alle weefsels, die het toetreden van Okazaki fragmenten tijdens de replicatie van DNA katalyseert en ook een rol in de reparatie van DNA speelt., DNA-ligases IIIa (922 aminozuren) en IIIb (862 aminozuren) zijn de producten van één enkel gen; zij verschillen in aminozuurvolgorde alleen aan hun carboxyl eindpunten als gevolg van alternatieve mRNA-splitsing. Ligase IIIa wordt alom uitgedrukt en is betrokken bij de reparatie van DNA en is essentieel voor de mitochondriale functie. De uitdrukking van Ligase IIIb is beperkt tot de testis, specifiek aan spermatocytes die meiosis ondergaan. Ligase IV van DNA is een 911-aminozuurpolypeptide dat een rol in de reparatie van de breuken van dubbel-bundel DNA via niet-homologe eind het toetreden (NHEJ) speelt.,

gistcellen bevatten 2 afzonderlijk gecodeerde DNA-ligasen, die homoloog zijn aan DNA-ligasen I en IV van zoogdieren. De DNA ligase I (Cdc9p) van de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is essentieel voor de celgroei. Genetische experimenten impliceren ligase I in het verzegelen van Okazaki fragmenten en in de voltooiing van DNA excisie reparatie. In tegenstelling, gist DNA ligase IV is niet essentieel voor celgroei. Nochtans, ontlokt de schrapping van het LIG4 gen fenotypes die erop wijzen dat ligase IV de reparatie van dubbelstrengbreuken in de niet-homologe eind verbindende weg (NHEJ) katalyseert., Ontluikende gist heeft geen schijnbare homoloog van DNA-ligase III van zoogdieren.

virale ATP-afhankelijke DNA-ligasen

bacteriële DNA-virussen, zoals de E. coli bacteriofagen T4, T6, T7 en T3, coderen hun eigen ATP-afhankelijke DNA-ligasen. ATP-afhankelijke ligases van DNA worden ook gecodeerd door eukaryotic virussen van DNA die sommige of elk van hun replicatiecyclus in het cytoplasma leiden. Deze omvatten vaccinia virus, Afrikaanse varkenspest virus, en Chlorella virus PBCV1. De bacteriofaag en eukaryotic virale ligases van DNA zijn kleiner dan hun cellulaire tegenhangers., De ligase van Vaccinia DNA, een 552-aminozuurpolypeptide, is opvallend gelijkaardig op het niveau van de aminozuurvolgorde aan zoogdierdna ligase III. inderdaad, is ligase III nauwer verwant aan vaccinia ligase dan aan zoogdierligasen i en IV. De ligasen van T4 (487 aminozuren), T7 (359 aminozuren), T3 (346 aminozuren), en Chlorella virus (298 aminozuren) zijn nog kleiner. We hebben aangetoond dat het Chlorella virus ligase de groei van een giststam kan aanvullen waarin het DNA ligase I gen is verwijderd., Dit resultaat suggereert dat de eiwitsegmenten die uniek zijn voor de veel grotere ligase I van DNA niet essentieel zijn voor de groei van gistcellen.

Nick-Sensing door DNA Ligases

we hebben de interactie van eukaryotische ligases met DNA onderzocht met behulp van virus-gecodeerde enzymen als modellen. Vaccinia virus DNA ligase en Chlorella virus DNA ligase vormen elk een discrete complex met een afzonderlijk gesneden DNA ligand in de afwezigheid van magnesium dat kan worden opgelost uit vrij DNA door inheemse polyacrylamide gel elektroforese., De virale ligases niet vormen stabiele complexen met de volgende liganden: (i) DNA met een 1-nucleotide-of 2-nucleotide gap; (ii) de verzegelde duplex DNA-product van de ligatie reactie; (iii) een afzonderlijk gejat duplex met een 5′-OH terminus op de nick in plaats van een 5′-fosfaat; of (iv) een afzonderlijk gejat duplex met een RNA streng op de 5′-fosfaat kant van de nick (10 tot 15). Aldus, hebben de virale ATP-afhankelijke ligases van DNA een intrinsieke nick-sensing functie.,

Nick-herkenning door vaccinia DNA ligase en Chlorella virus DNA ligase hangt ook af van de bezetting van de AMPÈREBINDINGSZAK op het enzym — d.w.z. mutaties van de actieve ligase-site die de capaciteit om het ligase-adenylaatintermediair te vormen afschaffen, elimineren ook nick-herkenning; terwijl een mutatie die de ligase-adenylaatvorming behoudt maar downstreamstappen van de bundelverbindingsreactie inactiveert, geen effect heeft op de binding aan gekneusd DNA., Sequestration van een extrahelical nucleotide door DNA-gebonden ligase doet denken aan het “base-flipping” mechanisme van de herkenning en katalyse van de doelplaats die door andere wijziging en reparatieenzymen van DNA wordt gebruikt.

hoewel het 5 ‘- fosfaatgedeelte essentieel is voor de binding van Chlorella virus ligase aan gekneusd DNA, is het 3′-OH gedeelte niet nodig voor nick herkenning. Chlorella virus ligase bindt aan een gekneusde ligand met 2′, 3′ dideoxy en 5′-fosfaat termini, maar kan adenylatie van de 5’-einde niet katalyseren., Aldus, is 3 ‘ – OH belangrijk voor stap 2 chemie ook al wordt het niet zelf chemisch getransformeerd tijdens DNA-adenylaatvorming.

om de ligase-DNA-interface af te bakenen, hebben we de ligase-bindingsplaats op DNA onderzocht. De grootte van de voetafdruk van exonuclease III van ligase die aan één enkele nick in duplexdna wordt gebonden is 19 aan 21 nucleotiden. De voetafdruk is asymmetrisch en strekt zich uit van 8 tot 9 nucleotiden aan de 3′-OH kant van de nick en van 11 tot 12 nucleotiden aan de 5 ‘ – fosfaat kant.,

kristalstructuur van eukaryotisch DNA Ligase-Adenylaat

Chlorella virus DNA ligase (ChVLig) is de kleinste eukaryotische ATP-afhankelijke ligase die bekend is. Als “minimale” ligase van DNA, presenteerde het een aantrekkelijk doel voor structuurbepaling. We kristalliseerden ChVLig en bepaalden de structuur op 2 Å resolutie. Het enzym bestaat uit een groter n-terminaal nucleotidyltransferase (NTase) domein en een kleiner C-terminaal ob domein met een spleet tussen hen. Een AMP-deel werd covalent verbonden met Nz van Lys27 op de actieve plaats., Zo hebben we de structuur van een echte katalytische tussenpersoon.

binnen het NTase-domein is een adenylaatbindingszak bestaande uit de zes peptidemotieven (I, Ia, III, IIIa, IV en V) die de covalente nucleotidyltransferase-enzymsuperfamilie definiëren die DNA-en RNA-ligasen en mRNA-afdekenzymen omvat. Motif I (KxDGxR) bevat de lysine waaraan AMP covalent verbonden wordt in de eerste stap van de ligasereactie. Aminozuren in motieven Ia, III, IIIa, IV, en v contactversterker en spelen essentiële rollen in één of meer stappen van de afbinding weg., Het ob domein bestaat uit een vijfstrengs antiparallel beta vat plus een alpha helix.

structurele Basis voor Nick – herkenning door een minimale “pluripotente” DNA-ligase

hoewel ChVLig de Grote n-of C-terminale flankerende domeinen in eukaryotische cellulaire DNA-ligases mist, kan het mitotische groei, DNA-herstel en niet-homologe eindverbinding in ontluikende gist ondersteunen wanneer het de enige bron van ligase in de cel is. ChVLig kan zelfs de essentiële functies van zoogdier Lig3 in mitochondriaal DNA metabolisme uitvoeren., We stelden voor dat ChVLig een gestripte “pluripotente” ligase vertegenwoordigt vanwege zijn intrinsieke nick sensing functie, waarvan de basis werd verlicht toen we de 2.3 Å kristalstructuur van ChVLig-AMP oplosten die gebonden is aan een 3′-OH/5′-PO4 nick in duplex DNA.

ChVLig omcirkelt het DNA als een C-vormige eiwitklem. Het NTase-domein bindt aan de gebroken en intacte DNA-strengen in de grote groef die de nick flankeert en ook in de kleine groef aan de 3′-OH kant van de nick. Het ob domein bindt over de kleine groef op het gezicht van de duplex achter de nick., Een nieuwe “latch” module-bestaande uit een beta-haarspeld lus die afkomstig is van het ob – domein-neemt de belangrijkste groef in beslag en voltooit de circumferentiële klem via contacten tussen het uiteinde van de lus en het oppervlak van het NTase-domein. De sluiting is van cruciaal belang voor de sluiting van de klem en is een belangrijke determinant van nick sensing.

vergelijking van de kristalstructuren van de vrije en nick-gebonden ChVLig-AMP toont een grote domein herschikkingen die nick herkenning begeleiden., In het vrije ChVLig-AMP wordt het ob-domein weg gereflecteerd van het NTase-domein om het DNA-bindende oppervlak boven de AMP-bindende zak volledig bloot te leggen. Het peptide segment dat is bestemd om de klink te worden is wanordelijk in de vrije ligase en gevoelig voor proteolysis. Maar dit segment is beschermd tegen proteolyse wanneer ChVLig bindt aan gekneusd DNA. De band van DNA impliceert een bijna 180 omwenteling van het ob-domein rond een wartel, zodat de concave oppervlakte van het BÃ tavat van OB in de minder belangrijke groef van DNA past., Deze overgang ontlokt een 63 Å beweging van het ob domein en plaatst de grendel diep in de grote groef van DNA.

een netwerk van interacties met de 3′-OH en 5 ‘ -PO4 termini in de actieve site verlichtte het DNA-adenylyleringsmechanisme en de kritische rollen van het AMP in nick-sensing en Katalyse. De toevoeging van een divalente kation veroorzaakte nick het verzegelen in crystallo, waardoor vaststellend dat het nick complex een bonafide tussenpersoon in de reparatieweg van DNA is.,

structuur van nad + – afhankelijke DNA Ligase gebonden aan gekneusde DNA-adenylaat

nad+-afhankelijke DNA ligases (aangeduid als LigA) zijn een onderscheidende en structureel homogene clade van enzymen die in alle bacteriën worden aangetroffen. E. coli LigA (671-aa) is het prototype van deze familie. LigA heeft een modulaire architectuur gebouwd rond een centrale ligase kern samengesteld uit een NTase domein en een ob domein. De kern wordt geflankeerd door een N-terminal “Ia” domein en drie C-terminal modules: een tetracysteïne zinkvinger, een helix-haarspeld-helix (HhH) domein, en een BRCT domein., Elke stap van de ligatieweg hangt van een verschillende subset van de LigA-domeinen af, met slechts het NTase-domein dat Voor alle stappen wordt vereist. Domein Ia is uniek aan nad + – afhankelijke ligases, is verantwoordelijk voor het binden van de NMN-groep van NAD+, en wordt vereist voor de reactie met NAD+ om de ligase-AMP tussenpersoon te vormen.

We vonden dat de nad + – afhankelijke E. coli DNA ligase de groei kan ondersteunen van Saccharomyces cerevisiae stammen die afzonderlijk worden verwijderd voor CDC9 of dubbel voor CDC9 plus LIG4., Dit is de eerste demonstratie dat een nad + – afhankelijk enzym biologisch actief is in een eukaryotic organisme. Latere studies (in samenwerking met Maria Jasin) toonden aan dat E. coli LigA kon volstaan voor ligase functie in muis ES cellen zonder het essentiële Lig3 enzym.

onze kristalstructuur van E. coli LigA die gebonden is aan het ingekapselde DNA-adenylaat intermediair toonde aan dat LigA ook de DNA-helix omcirkelt als een C-vormige eiwitklem. De interface eiwit-DNA impliceert uitgebreide DNA-contacten door NTase, OB, en HHH domeinen over een segment van 19 bp van duplexdna die over de nick wordt gecentreerd., Het NTase-domein bindt aan de gebroken bundels van DNA bij en flankerend de nick, het ob-domein contacteert de ononderbroken template bundel die de nick omringt, en het HHH-domein bindt beide bundels over de minder belangrijke groef bij de periferie van de voetafdruk. De Zn-finger module speelt een structurele rol in het overbruggen van de Ob en HhH domeinen. Domein Ia maakt geen contact met de duplex van DNA, consistent met zijn dispensability voor katalyse van bundelsluiting op een appdna-substraat.,

de LigA-NTase-en OB-domeinen worden op dezelfde manier geplaatst op de DNA-omtrek aan de NTase-en OB-domeinen van de ATP-afhankelijke DNA-ligases, en zij “voetafdruk” gelijkaardige segmenten van de DNA-bundels. Toch is de topologie van de LigA klem sterk verschillend van de klemmen gevormd door ChVLig en menselijk DNA ligase 1 (HuLig1, bepaald door Tom Ellenberger en collega ‘ s). De kissing contacten die de LigA klem sluiten zijn sui generis, waarbij het NTase domein en de C-terminal HHH domein., Gebaseerd op beschikbare structurele gegevens, is het duidelijk dat de ligases van DNA minstens drie verschillende middelen hebben geëvolueerd om DNA te omcirkelen.

Vergelijkingen van de E. coli-LigA—AppDNA complex met structuren van andere bacteriële ligases vastgelegd als de binaire LigA•—NAD+ complex (stap 1 substraat), binaire LigA•—NMN complex (de post-stap 1 het verlaten van de groep), en covalente ligase-AMP-gemiddeld (stap 1 product na het verlaten van de groep dissociatie) markeer enorme eiwit domein herschikkingen (in de orde van 50 tot 90 Å) die zich voordoen in synch met substraat-binding en katalyse., DNA-binding en klemvorming door LigA houdt een bijna 180 rotatie van het ob-domein in, zodat het concave oppervlak van het ob-beta-vat in de kleine groef past, vergelijkbaar met wat wordt gezien of afgeleid voor ChVLig en HuLig1. De vierpuntsbinding van het HHH-domein bij de periferie van de voetafdruk van LigA-DNA stabiliseert een DNA-bocht die bij de nick wordt gecentreerd. De LigA-DNA interacties die onmiddellijk de nick flankeren veroorzaken een lokale DNA vervorming, resulterend in de goedkeuring van een RNA-achtige a-vorm helix, die opnieuw de bevindingen voor het HuLig1-DNA cocrystal echoën.,

mechanisme van lysineadenylylering door ATP-afhankelijke en NAD+-afhankelijke polynucleotideligasen

De autoadenylyleringsreactie van polynucleotideligasen wordt uitgevoerd door een nucleotidyltransferase (NTase)-domein dat bewaard wordt in ATP-afhankelijke DNA-en RNA-ligasen en nad+ – afhankelijke DNA-ligasen. Het NTase-domein omvat het definiëren van peptide motieven die de nucleotide-bindende zak vormen. Motif I (KxDG) bevat de lysine die covalent aan het AMP wordt gehecht. Zoals Robert Lehman in 1974 wees, is het onduidelijk hoe lysine (met een voorspelde pKa waarde van ~10.,5) verliest zijn proton bij fysiologische pH om de onbewezen toestand te bereiken die nodig is voor de aanval op het α fosfor van ATP of NAD+. In principe kan ligase een algemene basis gebruiken om de lysine te deprotoneren. Alternatief, zou pKa door positief ladingspotentieel van eiwitaminozuren kunnen worden gedreven die lysine-Nz omringen. Verschillende kristalstructuren van ligasen zonder metalen leverden weinig ondersteuning voor beide verklaringen. In deze structuren, wordt het motief I lysine nucleofiel naast een motief IV glutamaat of aspartaat zijketen gevestigd., De lysine en het motief IV carboxylaat vormen een ionenpaar, waarvan het verwachte effect is om de pKa van lysine door het omringen van negatieve lading te verhogen. Het is onwaarschijnlijk dat een glutamaat of aspartaatanion als algemene basis zou kunnen dienen om een proton uit het lysinekation te abstraheren. Een mogelijke oplossing voor het probleem zou zijn als een divalente kation de lysine-Nz aantast en zijn pKa naar beneden drijft.,

een door metaal aangedreven mechanisme werd onthuld door onze recente kristalstructuur van Naegleria gruberi RNA ligase (NgrRnl) als een Michaelis-complex van Stap 1 met ATP en mangaan (de geprefereerde metaalcofactor). De sleutel tot het vastleggen van het Michaelis-achtige complex was de vervanging van het lysine nucleofiel door een isosterische methionine. De structuur van 1,9 Å bevatte ATP en twee mangaanionen in de actieve plaats. Het “katalytische” metaal werd gecoördineerd met de octaëdrische geometrie tot vijf wateren, die op hun beurt werden gecoördineerd door de carboxylaat zijketens van geconserveerde residuen in motieven I, III en IV., De zesde ligandplaats in het katalytische metaalcomplex werd ingenomen door een ATP α fosfaatzuurstof, wat wijst op een rol voor het metaal bij het stabiliseren van de overgangstoestand van de auto-adenylyleringsreactie. Een belangrijk inzicht, versterkt door superpositie van het Michaelis-complex op de structuur van het covalente NgrRnl-(Lys–Nz)-AMP-tussenproduct, betrof de rol van het katalytische metaalcomplex in het stabiliseren van de niet-geprotoneerde toestand van het lysinenucleofiel voorafgaand aan de katalyse, via lokale positieve lading en atomair contact van Lys-Nz naar een van metaalgebonden wateren., Het NgrRnl Michaelis-complex onthulde een tweede metaal, dat octaëder werd gecoördineerd tot vier wateren en tot ATP-β-En γ-fosfaatoxygenen. Het metaalcomplex en het ATP γ fosfaat werden geëngageerd door een ensemble van aminozuur zijketens (uniek aan ngrrnl) die collectief de PPI verlaten groep apicaal aan het nucleofiel van de lysine Oriënteren. Consistent met een single-step in-line mechanisme, werd het α fosfaat stereochemisch omgekeerd tijdens de overgang van NgrRnl•ATP Michaelis complex naar lysyl–AMP intermediair., er wordt aangenomen dat de DNA-ligasen los van de RNA-ligasen zijn geëvolueerd, aanvankelijk door fusie van een voorouderlijk ATP-gebruikend NTase-domein tot een C-terminaal ob-domein (dat de minimale katalytische kern van een DNA-ligase omvat), en vervolgens door de fusie van aanvullende structurele modules tot de NTase-OB-kern (7). Nad + – afhankelijke ligases van DNA( LigA-enzymen), die alomtegenwoordig zijn in bacteriën en essentieel zijn voor bacteriële levensvatbaarheid, verwierven hun specificiteit voor NAD+ via fusie van een NMN-bindende ia-domeinmodule aan de n-eindpunt van het NTase-domein., Escherichia coli DNA ligase (EcoLigA) was de eerste cellulaire DNA ligase ontdekt en gekarakteriseerd en het blijft het belangrijkste model voor structurele en functionele studies van de nad+-afhankelijke DNA ligase familie. De rente in LigA mechanisme wordt voortgestuwd door de belofte van het richten van LigA (via zijn handtekening nad+ substraatspecificiteit en unieke structurele eigenschappen ten opzichte van menselijke ligases van DNA) voor antibacteriële drugontdekking.

we losten een 1,55 Å kristalstructuur van EcoLigA op als een Michaelis-complex met NAD+ en magnesium., De structuur onthult een één-metaal mechanisme waarin een ligase-gebonden Mg2+ (H2O)5 complex de lysine pKa verlaagt en het nad + α fosfaat inschakelt, maar het β fosfaat en het nicotinamide nucleoside van de NMN verlaten groep zijn uitsluitend gericht via atomaire interacties met eiwitelementen die uniek zijn voor de LigA clade. De twee-metaal (voor ATP-afhankelijke ligase) versus één-metaal (voor nad+ – afhankelijke ligase) dichotomie markeert een vertakking in ligase evolutie.