00: 00:05.21 Hallo. Ik ga het hebben over de semi-conservatieve replicatie van DNA. Niet zozeer over de technische details, maar over hoe Frank Stahl en ik het experiment deden dat aantoonde dat DNA zich repliceert door de twee ketens die uit elkaar komen,
00:00:23.10 elk maakt een nieuwe kopie en dan krijg je er twee,
00:00:27.10 elk heeft een oude en een nieuwe keten.
00: 00: 30.,24 het is moeilijk om te weten waar een bepaald verhaal te beginnen
00: 00:34.06 maar laat me beginnen met de publicatie in 1953
00:00: 38.00 van het artikel door Watson en Crick. Er waren eigenlijk twee papers
00:00:41.29 in Nature. De eerste ging over de structuur
00:00:45.01 die gebaseerd was op modelbouw en een beetje informatie uit röntgendiffractie
00:00:50.15 de röntgendiffractie vertelde je zeker niet de structuur.00:00: 54.09 het vertelde je iets over de herhaalafstand langs de helix.00:00: 58.14 het vertelde je dat het een helix was en heel weinig meer.
00: 01: 02.,05 het Modelbouw was Modelbouw,00: 01: 04.27 dus de structuur was zeker niet bewezen.
00:01:07.13 dit was een voorstel en veel mensen geloofden het niet
00:01: 10.20 of gaven er misschien niet eens aandacht aan.00: 01: 13.10 in het tweede artikel werd voorgesteld hoe het molecuul zich zou kunnen vermenigvuldigen. De twee ketens zouden scheiden, elk zou leiden op zijn oppervlak
00:01:22.26 de vorming van een nieuwe keten, dus je zou
00:01:25.11 eindigen met twee dubbele helices, elke heeft
00:01:28.03 een van de oude ketens en een gloednieuwe keten.00: 01: 30.23 dat heet semi-conservatieve replicatie.,00:01:33.20 bij Caltech was Max Delbruck, die Jim Watson kende en met hem correspondeerde, pessimistisch over dit replicatieschema.00:01: 44.05 pessimistisch over semi-conservatieve replicatie.00:01:47.07 de kettingen werden om elkaar gewikkeld, dus om ze uit elkaar te krijgen
00:01:50.19 tenzij je ze breekt, moet je de basis dubbele helix losmaken
00:01: 55.18 om de twee armen uit elkaar te krijgen.Max dacht dat dit onmogelijk zou zijn, hydronamisch onmogelijk.
00:02:01.11 en dus stelde hij voor dat misschien de twee ketens gescheiden door een systeem van
00:02: 05.,21 het breken van elke nucleotide langs
00:02:09.12 de keten. En hij en Gunther Stent publiceerden een paper
00: 02: 12.17 waarin drie verschillende methoden voor DNA-replicatie werden voorgesteld.
00:02:15.27 Semi-conservatief, zoals Watson en Crick hadden voorspeld,
00:02:19.29 conservatief, waarin ten minste conceptueel misschien was er
00:02:22.28 een manier dat een dubbele helix kon leiden de vorming van
00:02:26.09 een andere dubbele helix net als in de buurt
00:02:28.19 en dus zou je nooit de ketens te scheiden helemaal.
00: 02: 33.,01je zou een gloednieuwe dubbele helix hebben en een volledig oude dubbele helix, en dat zou
00: 02: 37.02 de handeling van replicatie zijn.00:02: 39.12 en dan dispersief, de derde manier, breken de enkele ketens, scheiden de stukken, en dan zet alles weer in elkaar.00: 02: 47.18 Ik bezocht Max in zijn kantoor. Ik zat in scheikunde.00: 02: 52.24 ik was een student van Linus Pauling.
00:02:55.01 Max was over in de biologie, en hij vertelde me
00:02:57.04 over dit probleem, en het kwam bij me op dat men misschien
00:03:01.17 een experiment kon doen om de wijze van replicatie van DNA te achterhalen
00:03: 06.,04 gebaseerd op het gebruik van zware isotopen.00:03:08.15 Ik wou dat ik tijd had om u te vertellen waarom ik dacht aan zware isotopen 00:03:12.08 maar het had te maken met het nemen van een cursus die een stuk geluk was 00:03: 16.11 Linus Pauling ‘ s cursus over de aard van de chemische binding.00: 03: 19.10 waarin deuterium-en waterstofbindingen een belangrijke rol speelden.00:03:23.17 niettemin, het idee was om DNA te labelen met iets zwaars, 00:03: 29.00 ik denk niet dat ik dacht over, oh ja, het was deuterium ik dacht over op het moment.
00: 03: 33.,05Then om het label door het kweken van bacteriën of phages
00:03:37.11 in heavy medium, deuterium medium,
00:03:40,00 en schakel vervolgens de groei aan het licht medium
00:03:42.15 en plaatst deze in de centrifuge en zo zien waar de
00:03:45.20 DNA-ging-naar de top als u aangepast dat de dichtheid rechts
00:03:49.12 als het was al licht, naar beneden naar de bodem als het was allemaal zwaar,
00:03:54.03 en in het midden als het was half zware en half licht.
00:03:57.05 dat is een oversimplificatie, maar dat is de manier waarop ik dacht over het experiment
00:04: 01.09 op dat moment., Dit was ergens rond 1954.00:04:05.14 toen ging ik naar Woods Hole als onderwijsassistent
00:04:08.25 voor Jim Watson (hij woonde in Caltech de vorige termijn)
00:04: 14.02 in de fysiologie cursus.00:04:17.13 en op een dag als onderwijsassistent in die cursus 00:04:20.17 Jim Watson en Sydney Brenner, die de cursus gaven, waren in een kamer boven in een gebouw genaamd Het Lillie building, het Marine Biological Lab,
00:04:30.24 en Jim keek door het raam en wees naar beneden naar een boom
00:04:33.,18 under which was sitting a man who was, you couldn ‘ t tell from a distance,
00: 04: 38.05 but he was selling gin and tonic.00: 04: 40.18 hij had een grote kan gin en een groot ding tonic, en wat ijs en wat glazen en wat limoenen,
00:04: 45.22 en hij zou gin en tonic verkopen aan voorbijgangers, en met de winst kon hij wat gin en tonic voor zichzelf kopen.00: 04: 51.06 het werd de gin-tonic boom genoemd.00:04:53.29 maar Jim zei dat deze man dacht vrij veel van zichzelf,
00:04:57.15 dus laten we geven hem een echt moeilijk experiment te doen in de fysiologie klasse,
00:05: 02.,14 het beroemde Hershey-Chase experiment gedaan door twee mensen over een periode van tijd,
00:05:06.02 Hershey en Chase, en kijk of Stahl kon doen het allemaal in een middag
00:05:08.28 alleen. Nou, ik dacht dat was behoorlijk rot om samen te werken op deze arme man
00:05: 13.13 dus ik ging naar beneden en stelde me voor aan hem en vertelde hem wat in petto voor hem lag.00: 05:18.07 and he told me what he was doing in phage genetics 00:05: 21.07 and that he would be at Caltech the next year.00:05:23.28 dus we kwamen overeen om dit experiment samen te doen, onszelf, over hoe DNA repliceert 00:05: 29.,03 toen hij bij Caltech kwam. Ik moest eerst mijn röntgenkristallografie afmaken
00: 05:33.25 voordat Frank ons zou laten beginnen omdat hij zei dat het slecht zou zijn voor mijn personage om verder te gaan en een nieuw project te starten
00:05:40.14 toen ik mijn scriptiewerk nog niet had voltooid,
00:05: 43.03 wat röntgenkristallografie was.00:05:44.19 eindelijk heb ik de röntgenkristallografie gedaan
00:05: 47.21 en we konden het experiment starten.00:05:50.05 Frank en ik besloten dat we de methode
00:05:52.26 zouden moeten ontwikkelen voor het doen van deze dichtheidsgradiëntcentrifugatie
00:05: 55.,24en dus besteedden we een behoorlijk lange tijd, meer dan een jaar, aan het ontwikkelen van een methode die macromoleculen kon scheiden in een dichtheidsgradiënt.00:06:04.09 en om dat te doen zetten we in zuiver DNA
00:06:07.03 in een centrifuge en zetten het aan om te zien wat er gebeurde
00:06:10.16 en tot onze verbazing vormde zich een dichtheidsgradiënt
00:06: 14.20 voor onze ogen.00:06:16.14 dit was omdat het cesium-ion vrij zwaar is, vrij dicht, en het neigt naar de bodem in een krachtig centrifugaal veld
00:06:26.,09 en de diffusie wil dat het weer omhoog gaat om het te herdistribueren
00: 06:29.25 en bij evenwicht heb je een dichtheidsgradiënt waarin er meer cesiumchloride is
00:06: 34.25 bij de bodem dan bij de top.
00: 06: 36.27 en dus vormt de dichtheid gradiënt automatisch.00: 06: 40.08 dit hadden we niet verwacht.00: 06:41.13 We zagen het gebeuren, we dachten dat we een voorgevormde dichtheid gradiënt
00:06:45.00 in de centrifuge cel
00:06: 49.00 maar de centrifuge zelf maakt de dichtheid gradiënt.
00: 06: 51.,14So om een lang verhaal kort te maken, we kweekten bacteriën in zwaar stikstofmedium
00:06:57.14 en na vele groeigeneraties, zodat alles zou worden gelabeld met zwaar stikstof, wisselden we de bacteriën, centrifugeren ze en resuspenderen ze
00:07:07.25 in een licht medium en namen monsters op verschillende tijdstippen.00:07:11.26 het eerste experiment dat Frank me had gewaarschuwd, zou ik mixen als ik beide richtingen tegelijk zou doen, 00:07: 18.14 als ik zwaar naar licht en licht naar zwaar zou doen.00: 07: 20.16 en ik zei: “nee, Ik zal de tubes kleuren,” en ik heb het helemaal door elkaar gehaald.
00: 07: 25.,25zo was het onduidelijk welke buizen precies welke waren. Het tweede experiment
00: 07:30.28 we labelden experiment Nummer één en dat is wat we publiceerden,
00:07: 35.14 samen met experiment nummer 2, wat een herhaling was.00:07:38.23 en wat we ontdekten was natuurlijk dat
00:07: 42.09 de bacteriën van één generatie slechts één soort DNA hadden.00:07: 46.25 het had een dichtheid halverwege tussen zwaar en licht.00: 07:49.26 en bij de tweede bacteriële generatie waren er twee soorten DNA,
00:07: 53.19 halfzwaar en volledig licht.00:07: 56.27 nu moesten we dit artikel schrijven., Eigenlijk waren we nogal traag in het schrijven
00: 08:01.06 en dus Max Delbruck nam ons mee naar het marine lab
00:08: 04.26 in Corona del Mar, en sloot ons op in een torenkamer.00: 08: 08.00 dat deed hij letterlijk. Mary Delbruck, de vrouw van Max, bracht ons maaltijden,
00:08:11.25 maar sloot de deur weer,
00:08:15.05 totdat we – en er was een typemachine-
00:08:16.13 totdat we een conceptmanuscript produceerden, wat we deden.00: 08: 20.06 maar er was een vraag hoe dit op te schrijven.00:08:22.01 er waren twee manieren die we bespraken.
00: 08: 24.,20een manier is om te beginnen met een hypothese, de Watson-Crick hypothese,
00:08:28.25 en zeg hier is een test, we doen dit experiment.00:08: 31.26 en kijk of het werkt zoals ze zeiden dat het zou moeten.00:08:36.13 en dat is zeker een manier om een experiment te doen, en Richard Feynman, die zeer dicht bij studenten in die dagen was, kwam naar onze feesten en ga zo maar door. Hij vond dat we het zo moesten opschrijven.00: 08:47.08 de andere manier zou zijn om precies te schrijven wat je experiment zei, niet meer, niet minder
00:08: 53.,19zonder verwijzing naar alle hypothesen op alle,
00: 08: 56.00 en dan aan het einde zeggen of het kan instemmen met een aantal hypothese.
00:09:00.15 we kozen voor de laatste manier, deels omdat we dachten, nou, als je probeert om een hypothese te testen,
00:09:07.01 de enige manier om echt zeker te zijn dat je gelijk hebt
00:09: 10.03 is om alle mogelijke hypothesen te kennen.00:09:13.26 en omdat niemand alle mogelijke hypothesen kan kennen
00:09:16.06 alleen omdat je experiment het met een van hen eens zou kunnen zijn
00:09: 18.29 bewijst niet dat dat de juiste hypothese is.
00: 09: 21.,02There could be another one that your experiment agrees with
00:09:24.20 So it seemed to us more elegant to write our paper
00:09:27.21 up in terms of subunits, and only at the end say,
00:09:30.19″ah, these subunits could be the single chains of the Watson-Crick model,”
00:09: 35.13 which of course they were. Dus dat is wat we deden.
00: 09: 37.22 en dan dit diagram hier toont het resultaat in termen van subeenheden
00: 09: 42.10 niet DNA-ketens. Wat we deden was gezegend door veel ongelukken.00: 09: 48.11 het ongeval van het zijn op Caltech,
00: 09: 50.,00:09:52.10 het ongeluk dat Max Delbruck indruk op je maakt 00:09:55.27 met zijn diepe pessimisme dat DNA onmogelijk kan repliceren 00:09: 59.07 de Watson en Crick werken zoals het werkt.
00: 10:02.26 en tot slot het ongeluk van het ontdekken dat de centrifuge zelf
00:10:06.16 een dichtheid gradiënt zal maken, je hoeft niet
00:10: 09.06 een reeds bestaande te maken.00:10: 11.01 het effect van dit experiment is het waard om iets over te zeggen.
00: 10:14.13 wanneer de DNA-structuur werd voorgesteld, een partij
00:10: 16.,14 van de mensen geloofden het niet.00: 10: 18.01 en er waren niet veel verwijzingen naar in de literatuur.00: 10: 20.18 voor de eerste jaren na 1953.
00: 10: 24.04 het was immers gebaseerd op Modelbouw, wat niets bewijst.00:10:27.23 het zag er zo mooi uit dat sommige mensen ervan overtuigd waren dat het juist moest zijn omdat het er zo goed uitzag.00:10: 34.19 andere mensen waren ervan overtuigd dat het niet goed kon zijn omdat het er te mooi uitzag om waar te zijn.
00: 10: 40.04 in ieder geval was het gewoon een model.
00: 10: 44.,Het bewijs van de röntgendiffractie was niet erg ondersteunend.
00:10:48.22 het toonde aan dat de herhaalafstand een bepaalde
00:10:52.04 afstand was en dat het spiraalvormig was, maar je kon geen details afleiden uit die vroege röntgenfoto ‘ s.00:10:58.02 ik denk dat het effect van ons experiment niet echt een ontdekking was, het was een psychologisch effect. Het DNA leek echt. Plotseling kon je
00:11:07.22 banden in een centrifuge zien.00:11: 09.27 die zich gedragen zoals Watson en Crick zeiden dat ze dat moesten doen.
00: 11: 14.,02en ik denk dat de belangrijkste waarde van het experiment was
00:11:18.04 dat het de psychologische waarde had om veel mensen te overtuigen
00:11: 21.18 dat de DNA-structuur juist moest zijn.00: 11: 24.29 laat me iets zeggen over dat molecuul.00:11: 27.20 dit molecuul gaf in wezen orders aan een hele periode in de ontwikkeling van de moleculaire biologie.00: 11:34.12 hier is deze dubbele helix, die daar staat,
00:11: 36.16 en het zegt, “Hier ben ik. Ik heb twee kettingen. Zoek uit hoe ik repliceer.”
00: 11: 41.13 ” Here I am. Ik heb vier soorten bases.”
00: 11: 44.,05 ” ga uitzoeken hoe dat wordt omgezet in het maken van eiwitten.00: 11: 47.26 ik zit in de kern. De proteã nen worden gemaakt in het cytoplasma in eukaryotes.00: 11: 52.21″ga uitzoeken wat het is dat deze informatie van mij naar het cytoplasma brengt.”
00:11: 56.21″mijn informatie die bestaat uit deze bases verandert af en toe.”
00: 12: 01.09″dat heet mutatie. Zoek uit hoe dat gebeurt.”
00:12: 04.08″af en toe is er iets dat genetische recombinatie wordt genoemd.”
00: 12: 08.10″ga uitzoeken hoe ik ben…”Wat ik hier probeer te zeggen
00: 12: 11.,16is dat als ik je een model liet zien van bijvoorbeeld een polysaccharide, zou het je vertellen welk experiment je vervolgens zou moeten doen?00:12:17.11 dit molecuul, DNA, is als de tovenaar van Oz
00:12:20.11 staat daar (behalve in tegenstelling tot de tovenaar is dit een echt molecuul)
00:12:24.04 staat daar en vertelt je in wezen de hele agenda
00:12: 29.25 voor de toekomst van de wetenschap voor de komende 20 jaar.00:12:32.07 nu dat is een heel andere stemming en houding, denk ik,
00:12:37.03 van de wetenschap die ervoor ging
00:12: 39.15 en de biologische wetenschap die erna kwam.,00: 12: 42.25 dus dat was de munteenheid van deze tijd.00:12:44.06 het was het DNA-molecuul dat je vertelde wat de problemen waren, en wat je moest gaan oplossen.