ontwerp van de synthetische acetyl-CoA-route
De eenvoudigste manier om organische koolstof uit één-koolstof te synthetiseren is het één voor één te construeren., Om van één koolstof een kunstmatige acetyl-CoA-weg te bouwen, stelden wij de synthetische acetyl-CoA (SACA) weg voor, waar twee molecules van formaldehyde in één molecuul van acetyl-CoA door slechts drie stappen zouden worden overgebracht (Fig. 1 bis). Ten eerste, formaldehyde zou worden gecondenseerd in glycolaldehyde (GALD) door de glycolaldehyde synthase (GALS). En dan zou glycolaldehyde worden omgezet in acetyl-fosfaat (ACS) door de acetyl-fosfaat synthase (ACS) met behulp van anorganisch fosfaat. Ten slotte zou AcP worden gebruikt voor de productie van acetyl-CoA door het bekende enzymfosfaat acetyltransferase (PTA)25., Ondertussen kan formaldehyde worden verkregen door het verminderen van kooldioxide en formiaat26 of het oxideren van methaan en methanol27. Aldus konden wij de biosynthese van acetyl-CoA van formaldehyde en zelfs andere één-koolstofbronnen realiseren.
beschrijving en computationele analyse van de SACA-route. a het SACA pad werd gemarkeerd in het Rode Paneel. De belangrijkste grondstof voor formaldehyde zou methanol, formiaat en zelfs methaan en CO2 kunnen zijn., Het product van acetyl-CoA kan worden gebruikt om belangrijke cellulaire voedingsstoffen te produceren. b de thermodynamische gegevens van drie ontworpen routes voor acetyl-CoA synthese werden gegenereerd door de website van eQuilibrator (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG ben: de totale Gibbs energie veranderen; Werk: het aantal reacties van formaldehyde aan acetyl-CoA in de bestudeerde trajecten; MDF: de maximale drijvende kracht; Opbrengst: de totale opbrengst van koolstof in de bestudeerde trajecten; co-enzymen: het aantal co-enzymen wordt gebruikt in de bestudeerde trajecten
De thermodynamica kunnen reflecteren of een pad konden effectief worden uitgevoerd in vivo of in vitro. We berekenden de thermodynamische chemische stuwkracht van de ontworpen SACA-route., De algemene reactie van formaldehyde aan acetyl-CoA is hoogst thermodynamisch gunstig, waar de totale verandering van de Gibbs energie (ΔrG ‘ m) van de gehele reactie ongeveer -96.7 kJ mol−1 is (Fig. 1b en aanvullende tabel 1). De waarde van MDF (maximum driving force) wordt meestal gebruikt om de thermodynamische en kinetische kwaliteit van verschillende pathways28 te evalueren. Als het MDF voldoende hoog is, bevat de route geen thermodynamische knelpunten die de werking ervan in vivo zouden belemmeren. De SACA-route behaalde de relatief hoge MDF-waarde van 26.,9 kJ mol−1, wat duidelijk hoger is dan de FLS-en MCC-routes (hun MDF−waarden zijn respectievelijk 1,9 en 5,8 kJ mol-1). Daarom is de SACA-weg thermodynamisch gunstig voor de biosynthese van acetyl-CoA van formaldehyde.
Identificatie van een nieuw enzym van C1 tot C2
de condensatie van formaldehyde kan worden gekatalyseerd door de n-heterocyclische karabijn in chemie29,30. In de biologie heeft de thiazoliumring van de cofactor thiamine difosfaat (ThDP) een vergelijkbare functie, die één aldehyde zou kunnen activeren en vervolgens dimeer zou kunnen vormen met een andere aldehyde31., Om een enzym te vinden om twee molecules van formaldehyde in één molecuul van glycolaldehyde te condenseren, verwezen wij naar de katalytische mechanismen van thdp-afhankelijke enzymen en construeerden een theozymemodel, dat ThDP, glycolaldehyde, en glutamic zuur omvat dat elektron voor de reactie levert 32 (Fig. 2 bis). Alle enzymen in Eiwitdatabank (PDB) werden vrijwel gescreend gebaseerd op het theozyme-model en 37 niet-redundante eiwitstructuren met ligand ThDP werden bereikt (aanvullende Fig. 1 en aanvullende aantekening)., Volgens de katalytische mechanismen van thdp-afhankelijke enzymen33,34,35 is C2-atoom in ThDP het actieve centrum. De afstand tussen C2-atoom en het product van glycolaldehyde is van cruciaal belang voor het activeren van de katalytische reactie (Fig. 2 bis). Zo analyseerden we de afstand tussen C2-atoom en glycolaldehyde in elk kandidaat-eiwit.
theozyme modelconstructie en functionele identificatie van de glycolaldehyde synthase., a de theozyme-modelinteractie tussen glycolaldehyde en de actieve centra van verschillende thdp-afhankelijke enzymen. Het glutamaat (glu) is bruin; glycolaldehyde is cyaan; ThDP is groen. De afstanden tussen C2 atoom in ThDP en glycolaldehyde koolstofatomen worden vertegenwoordigd door d1 en d2. De groene stip is magnesiumion. B De gemiddelde afstanden (blauw) tussen d1 en d2 in elk eiwit zijn links weergegeven. De hoeveelheid product (Geel) voor het geteste eiwit staat rechts afgebeeld. De reactie werd uitgevoerd door 1 mg mL−1 van de geteste eiwitten en 2 g L−1 formaldehyde toe te voegen. En geen opsporing., Foutbalken staan voor S. d. (standaarddeviatie), n = 3. C eiwitexpressie van drie functionele kandidaten door 1 mL van 1 od-cellen te gebruiken. M: eiwit markering; 1, 3 en 5 vertegenwoordigen eiwit expressie zonder IPTG voor 2UZ1, 3FZN, en 4K9Q, respectievelijk, 2, 4, en 6 vertegenwoordigen eiwit expressie onder IPTG induceren voor 2UZ1, 3FZN, en 4K9Q, respectievelijk; De rode pijlen wijzen naar het eiwit bands voor 2UZ1, 3FZN, en 4K9Q, respectievelijk. Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.,
Op basis van de gemiddelde afstanden in elk eiwit met behulp van moleculaire docking (aanvullende gegevens 1)36 werden zes kandidaten met korte afstanden en duidelijke functionele annotaties gedefinieerd als kandidaten (Fig. 2b en aanvullende tabel 2). Bovendien werden drie proteã nen met lange afstanden willekeurig gekozen als controles. De kandidaten en controles werden uitgedrukt en gezuiverd om hun vermogen te testen om glycolaldehyde uit formaldehyde te produceren., Drie van de zes kandidaten vertoonden de gewenste activiteit, terwijl drie controles niet de functie hadden, wat aangeeft dat de afstand tussen C2-atoom en glycolaldehyde een cruciale rol speelt op de condensatie van formaldehyde. Van drie actieve kandidaten werd gemeld dat het eiwit 2uz1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) dat benzaldehyde lyase (BAL) werd genoemd, bij voorkeur dihydroxyaceton (DHA) genereerde ondanks de minimale opbrengst van glycolaldehyde wanneer de concentratie formaldehyde lager was37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
gerichte evolutie van de glycolaldehydesynthase
aangezien BAL was ontwikkeld om DHA te produceren uit formaldehyde22, stelden we voor om te detecteren of de overeenkomstige mutaties in BFD ook zouden bijdragen tot verbetering van de enzymactiviteit (aanvullende Fig. 2). Door alle gemuteerde residuen te screenen, vonden we inderdaad een zeer actieve mutatie W86R-N87T die zich in het substraatkanaal van BFD bevond (aanvullende Fig. 3). Aldus werd deze mutatie (W86R-N87T) in BFD geà ntroduceerd en de variant werd gemarkeerd als M1., Om de katalytische activiteit van BFD verder te verbeteren, stelden we voor om alle residuen rond het actieve centrum van BFD te screenen, waar 25 posities binnen 8 Å afstand van het actieve centrum werden geselecteerd om eenpuntsverzadiging mutagenese te doen (aanvullende Fig. 4). We ontwikkelden een high-throughput screening benadering om glycolaldehyde te detecteren door middel van kleur reactie tussen glycolaldehyde en difenylamine, die werd gemeten door spectrofotometrically monitor bij 650 nm (aanvullende Fig. 5)., Na screening bleek dat 14 van de 25 posities hogere activiteiten vertoonden dan M1 mutant (aanvullende Fig. 6). Vervolgens werden 14 posities verdeeld in 8 groepen: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378) en H (T379/T380). N27 werd drie keer gebruikt omdat de varianten in deze positie de hoogste activiteit vertoonden. Met M1 als template introduceerden we elke groep mutaties in M1 en selecteerden we de hoogste actieve mutant, die werd gelabeld als M2., Door het uitvoeren van drie rondes van iteratieve combinatorische mutagenese tussen deze posities, hebben we totaal 64.512 klonen gescreend en een high activity mutant verkregen die vijf nieuwe mutaties rond het actieve centrum bevat. Tenslotte werd de variant met 7 residumutaties aangeduid als glycolaldehyde synthase (GALS). De kcat van GALS werd ongeveer 160-voudig verbeterd en de uiteindelijke katalytische efficiëntie van GALS is 9,6 M-1 * s-1, wat ongeveer 70-voudig is dan het startenzym (Fig. 3a en aanvullende Fig. 7).
eiwit engineering en mechanism analysis of the glycolaldehyde synthase. a kinetische parameters van gew. en mutanten. WT: wild-type; M1: mutaties bij W86R en N87T; M2: mutaties bij W86R, N87T, L109G, en L110E; M3: mutaties bij W86R, N87T, L109G, L110E en A460M; M4: mutaties bij W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V, en Q282F. b Het overzicht van de geselecteerde vijf mutaties in het actieve centrum. IMA: intermediair analoog; de oranje lijnen geven de waterstofbindingen aan tussen de hydroxylgroep van IMA en de mutatie L110E., c de zakvolumes van M1, M2, M3 en M4. Roze stippen vertegenwoordigen de volumes van de bindzakken (aanvullende gegevens 2), die respectievelijk 131,25, 161,50, 133,38 en 171,38 Å3 zijn. De cijfers werden weergegeven met behulp van UCSF Chimera software Versie 1.1246. Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.
om erachter te komen hoe deze mutaties de enzymactiviteit verbeteren, stelden we voor om de kristallisatie van meisjes opnieuw uit te voeren. De actieve pocket bevindt zich op de interface van homodimer van GALS38., De eiwitstructuur van GALS kan verschillen van het beginnende eiwit na verschillende rondes van mutatie. Hier kristalliseerden we het eiwit van GALS en haalden we de kristalstructuur van GALS terug met behulp van de structuur van BFD als zoekmodel (aanvullende tabel 3). De kristalstructuur van GALS werd geanalyseerd (aanvullende Fig. 8, Aanvullende Fig. 9). We vonden dat de mutatie van L110E twee extra waterstofbindingen introduceert aan de hydroxylgroep van intermediair analoog (IMA), die kunnen bijdragen aan het stabiliseren van de overgangstoestand en het splitsen van C–C binding tussen product en cofactor ThDP (Fig. 3b)., De mutatie van L109G vergrootte het volume van de substraatbindingszak door de grote isobutylgroep te vervangen door een waterstofgroep. De derde verandering van A460M kan het substraat heroriënteren en dan de interactie tussen ThDP en substraat verbeteren. De laatste twee veranderingen h281v en Q282F breidden de poriestraal van buitenoppervlakte uit en kunnen toegang voor substraat of product vergemakkelijken (Fig. 3c). In vergelijking met M1 werd het volume van de reactiezak in GALS vergroot met meer dan 30%, wat de belangrijkste reden zou zijn voor de verbetering van de katalytische activiteit.,
Identificatie van de acetylfosfaatsynthase
In de natuur werd geen enkel enzym gerapporteerd dat de synthese van ACP uit glycolaldehyde tot stand bracht. Phosphoketolases (PKs) kunnen ACS produceren uit fructose-6-fosfaat (F6P) of xylulose-5-fosfaat (X5P)39. Volgens het katalytische mechanisme van PKs is het mogelijk dat glycolaldehyde interageert met ThDP en dan 2-α,β-dihydroxyethylideen-ThDP (DHEThDP) genereert (Fig. 4a), die de belangrijkste tussenpersoon van het vormen van ACS van F6P of X5P door PKs is. Om onze hypothese te bevestigen, selecteerden we acht kandidaten (Fig., 4b) gebaseerd op de fylogenetische boom van PKS uit 111 bacteriënfamilies (aanvullende Fig. 10). Na gensynthese en eiwitzuivering (aanvullende Fig. 11), onderzochten we de katalytische activiteit van alle kandidaat-eiwitten met behulp van glycolaldehyde als substraat. Gelukkig vertoonden vijf van de acht pk ‘ s significante katalytische activiteiten. Alleen PK1, PK4 en PK8 vertoonden geen significant verschil met de blanco controle. Zo werd PK2 met de hoogste activiteit acetylfosfaat synthase (ACS) genoemd, waarvan kcat / Km 3,21 M−1·s−1 (aanvullend Fig. 12).,
computationele analyse en functionele identificatie van de acetylfosfaatsynthase. a de vorming van DHEThDP uit F6P / X5P en glycolaldehyde. De vaste pijlen vertegenwoordigen het vormingsmechanisme van DHEThDP in ref. 39; De stippelpijlen geven het voorspelde proces aan met glycolaldehyde als substraat. b de identificatie van ACS ‘ s. De maximale waarschijnlijkheid fylogenetische boom van de geselecteerde acht PKs werd geconstrueerd door MEGA47., De details van de geselecteerde PKs zijn aanwezig in de aanvullende noot en de aanvullende Fig. 10. De activiteit van elk eiwit werd gedetecteerd door toevoeging van 0,5 mg mL−1 enzym en 10 mM glycolaldehyde. AcP acetylfosfaat, pk fosfoketolase, productie van AcP (µmol min – 1 mg-1): de hoeveelheid AcP geproduceerd per mg enzym per minuut; controle: geen enzym toegevoegd aan het reactiesysteem; foutbalken vertegenwoordigen S.d. (standaarddeviatie), n = 3. c het energieprofiel voor het DHEThDP-vormingsproces., IM1 en IM2 vertegenwoordigen intermediair 1 en 2 tijdens het formatieproces; TIM vertegenwoordigt de tautomerized tussenpersoon tussen IM1 en IM2; TS1 en TS2 vertegenwoordigen de overgangstoestanden. Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.
om het mechanisme van de vorming van DHEThDP uit glycolaldehyde te onthullen, stelden we voor om een theoretische analyse uit te voeren op basis van het vorige rekenmodel van PK40. Alle mogelijke aminozuren met betrekking tot de vorming van DHEThDP werden gebruikt om het computationele model (aanvullende Fig. 13)., Gebaseerd op computationele simulatie, vonden we dat de energiebarrière slechts 11,36 kcal mol−1 is voor de vorming van IM1 (intermediair 1) wanneer glycolaldehyde werd geprotoneerd door His553, die werd beschouwd als de meest mogelijke Proton donor40 (Fig. 4c). Dan, tautomerizes IM1 in IM2 met de hulp van Glu479 en Glu437. IM2 is energetisch stabieler dan IM1. Wanneer het proton van IM2 door N4′ in ThDP werd verwijderd, is de energiebarrière van IM2 naar de belangrijkste intermediaire DHEThDP 15.,13 kcal mol−1, die zo gelijkaardig is als de spanningsenergie tijdens de vorming van DHEThDP gebruikend F6P als substrate40. Na de vorming van DHEThDP zijn de volgende katalytische processen hetzelfde als andere PKs (aanvullende Fig. 14), dat wil zeggen, H97 fungeert als Proton donor van dehydratatieproces van DHEThDP, en His142 en Gly155 versnellen het dehydratatieproces van DHEThDP, te oordelen naar het feit dat His142 en Gly155 vormen waterstofbindingen met het watermolecuul in structuur van de post-dehydratatie intermediair (AcThDP)., His64, Tyr501, en Asn549 zijn belangrijk voor de nucleofiele aanval door Pi en zij vormen samen de bindingsplaats van Pi39. Uit locatiegerichte mutagenese-experimenten bleek ook dat deze residuen van cruciaal belang zijn voor de enzymactiviteit (aanvullende Fig. 15).
synthese van acetyl-CoA uit formaldehyde in vitro
met het eerste succesvolle ontwerp van GALS en ACS ‘ s was het de bedoeling om de SACA-route in vitro te construeren om acetyl-CoA uit formaldehyde te synthetiseren. Ten eerste, we gemeten de opbrengst van glycolaldehyde door GALS onder verschillende concentraties van formaldehyde., De resultaten toonden aan dat GALS effectief de dimerisatie van formaldehyde kunnen katalyseren, en de opbrengst van glycolaldehyde verhoogd met de concentratie van substraat verbeterd (Fig. 5a). Zo nam de opbrengst van glycolaldehyde uit formaldehyde toe van 45% bij 0,5 g L−1 tot 80% bij 2 g L−1. In de tweede plaats hebben wij de katalytische efficiëntie van glycolaldehyde naar ACS onderzocht, die werd gekwantificeerd door het gehalte aan azijnzuur, aangezien de ACS snel zou worden afgebroken tot azijnzuur (aanvullende Fig. 16)23., Uit de resultaten bleek dat de ACS-opbrengst bij verschillende concentraties glycolaldehyde via ACS-landen meer dan 80% bedroeg (aanvullende Fig. 17). Helaas werd ACP ‘ s duidelijk geremd door formaldehyde (Fig. 5b). Daarom is het noodzakelijk om een evenwicht te vinden voor de concentratie formaldehyde bij het oplossen van dit conflict.
bevestiging van de biosynthese van acetyl-CoA uit formaldehyde via de SACA-route in vitro. a de synthese van glycolaldehyde uit formaldehyde door GALS., De reacties werden uitgevoerd onder verschillende formaldehydeconcentraties met 2 mg mL−1 gezuiverde GALS bij 37 °C gedurende 2 uur B de remming van ACS ‘ s door formaldehyde. De opbrengst aan azijnzuur werd op verschillende tijdstippen gemeten met reactiebuffer, 2 mg mL-1 ACS, 0,75 g L-1 glycolaldehyde en de gradiënt van formaldehyde van 0 tot 2 g L−1, die werd weergegeven door verschillende kleurlijnen. C opbrengst van azijnzuur uit verschillende formaldehydeconcentraties. Reacties werden ‘ s nachts uitgevoerd bij 37 °C met reactiebuffer, 2 mg mL−1 GALS, 2 mg mL−1 ACS en de gradiënt van formaldehyde van 0.,5 tot 2 g L-1. d opbrengst van azijnzuur of acetyl-CoA uit 1 G L-1 formaldehyde. De opbrengsten van azijnzuur of acetyl-CoA werden op verschillende tijdstippen gemeten. De blauwe lijn vertegenwoordigt het reactiesysteem om acetyl-CoA te produceren (met 20 mM CoA−voeding en 2 mg mL-1 van de gezuiverde GALS, ACS ‘s, en PTA, respectievelijk); de oranje lijn vertegenwoordigt het reactiesysteem om azijnzuur te produceren (met 2 mg mL−1 GALS en ACS’ s en zonder COA-voeding). De steekproeven in alle analyses werden geanalyseerd door HPLC. Foutbalken staan voor S. d. (standaarddeviatie), n = 3., Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.
om de concentratie formaldehyde te optimaliseren, werd een gradiëntexperiment uitgevoerd met behulp van het reactiesysteem dat 2 mg mL−1 GALS en ACS ‘ s bevat. Met het verhogen van de concentratie van formaldehyde, nam de opbrengst van azijnzuur in het systeem aanvankelijk toe en nam vervolgens af (Fig. 5c). Wanneer de concentratie formaldehyde 1 g L-1 is, bereikt de opbrengst van azijnzuur tot 50,6%., Interessant is dat de uiteindelijke opbrengst van azijnzuur zelfs hoger is dan die in het reactiesysteem van glycolaldehyde naar AcP met dezelfde hoeveelheid formaldehyde (Fig. 5b, grijze lijn). Dit zou worden veroorzaakt door het gedeeltelijk vrijgeven van de functie van ACS omdat formaldehyde geleidelijk werd geconsumeerd door GALS. Gebaseerd op dit systeem, voegden wij verder een ander bekend enzymfosfaat acetyltransferase (PTA) toe, dat ACS in acetyl-CoA zou omzetten. Ten slotte produceerde de SACA-route 5,5 mM acetyl-CoA bij de formaldehydeconcentratie van 1 g L-1. De opbrengst van acetyl-CoA uit formaldehyde was ongeveer 33% (Fig. 5d)., De opbrengst van azijnzuur (7,8 mM) uit formaldehyde (33,3 mM) bereikte echter tot 50% als PTA en CoA niet werden geleverd. De lagere opbrengst van acetyl-CoA dan die van azijnzuur zou worden veroorzaakt door de instabiliteit van acetyl-CoA en AcP. Onze resultaten toonden aan dat het succesvol is voor de biosynthese van acetyl-CoA uit formaldehyde door de SACA-route in vitro.,
validatie van de SACA-route door 13C-etikettering
na bepaling van de SACA-route met gezuiverde enzymen in vitro, hebben we verder geprobeerd om de biosynthese van acetyl-CoA en zijn derivaten van de SACA-route in vivo te testen door 13C-metabole tracer assays (Fig. 6 bis). Ten eerste, werden de cellysaten gebruikt om de biosynthese van acetyl-CoA door de toevoeging van 13C-geëtiketteerd formaldehyde en CoA te verifiëren. We ontdekten een significante toename van de dubbele 13C-gelabelde acetyl-CoA dan andere controles (P-waarde < 0,001, T-test) (Fig. 6b en aanvullende Fig. 18)., Bovendien verdween de toename van dubbel 13C-gelabeld acetyl-CoA als we een van genen in de SACA-route weglaten zoals ACPS en PTA (aanvullende Fig. 19). Bovendien zou acetyl-CoA met oxaloacetaat worden geconvergeerd om in de tricarbonzuurcyclus (TCA) te komen. We ontdekten ook significant meer dubbel 13C-gelabeld fumaraat (P-waarde < 0,001, T-test) en malaat (p-waarde < 0,001, T-test) alleen in de stam met de SACA-route en 13C-gelabeld formaldehyde voeding (Fig. 6b en aanvullende Fig. 18)., We hebben echter geen significante verschillen in hogere orde massa isotopomeren ontdekt. Het zou worden veroorzaakt door de lage hoeveelheid dubbel 13C-geëtiketteerde isotopomeren in de TCA-cyclus.
13C-gelabelde metabole tracer analyse van de SACA-route. een schematisch diagram van de geteste route voor 13C-gelabelde tracer. b DE Fractie van M + 2 samenstellingen in cellulaire lysaten met 13C-geëtiketteerd of unlabeled formaldehyde. c de fractie van 13C-gelabelde metabolieten., Cellen werden geïnduceerd in LB en overgebracht naar M9 medium met 13C-gelabeld methanol. Intracellulaire metabolieten werden gedetecteerd na 16 uur incubatie en proteïnogene aminozuren werden gemeten na 26 uur incubatie. De som van de gedetecteerde isotopomeren werd vastgesteld op 100%., 13C-FALD 13C-gelabeld formaldehyde, m + 0 zonder 13C labelen, m + 1 single 13C labelen, m + 2 dubbele 13C labelen, FALD formaldehyde, MeOH methanol, GALD glycolaldehyde, de Acs-acetyl -, fosfaat -, Asp-aspartaat, Glu glutamaat, PEP phosphoenolpyruvate, SACA van de stam bevat de vector GALS-ACS-PTA-28, 28 bis, de stam bevat de lege vector van 28a, BsMDH-SACA de stam bevat zowel BsMDH-pcdf ‘ s en GALS-ACS-PTA-28a vectoren, BsMDH-28a: de stam bevat zowel BsMDH-pcdf ‘ s vector en de lege vector 28a. Foutbalken geven s.d. (standaard afwijking), n = 3., Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.
vervolgens hebben we voorgesteld om de koolstofstroom binnen cellen te testen. Wegens de giftigheid van formaldehyde aan cellen, introduceerden wij methanol dehydrogenase van Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 om een onophoudelijk lage concentratie van formaldehyde in vivo te handhaven (Fig. 6 bis). De gecultiveerde cellen werden geoogst op verschillende tijdstippen en werden gebruikt om proteïnogene aminozuren en intracellulaire metabolieten te detecteren (Fig. 6c)., We vonden dat de stam met de SACA-route (BsMDH-SACA) meer dubbel 13C-gelabeld aspartaat en glutamaat bevatte, die uit de TCA-cyclus werd afgeleid. Bovendien werden de 13C-geëtiketteerde glucose en fosfoenolpyruvaat, die uit dubbel 13C-geëtiketteerde oxaloacetaat via de gluconeogeneseweg zouden kunnen produceren, meer in de stam BsMDH-SACA ontdekt dan die in de controlestam (BsMDH-28a). Zo gaven onze resultaten aan dat de SACA-weg functioneel is voor het produceren van acetyl-CoA en acetyl-CoA-afgeleide metabolieten uit formaldehyde.,
evaluatie van de SACA-route door celgroei
om de SACA-route in vivo verder te evalueren, stelden we voor om de celgroei stapsgewijs te testen door elk tussenproduct in de route te voeden. Aanvankelijk groeide E. coli Onder het rijke medium op en toen werd glycolaldehyde toegevoegd als aanvullende koolstofbron. Door toevoeging van verschillende concentraties glycolaldehyde (aanvullende Fig. 20), vonden we dat de gemanipuleerde stam die de SACA-route met meer dan 0 bevat.,4 g L-1 glycolaldehyde toevoer heeft Opmerkelijk hogere OD600 dan die stammen zonder glycolaldehyde of de SACA-route (Fig. 7a en aanvullende Fig. 21). De bijdrage van glycolaldehyde aan biomassa (cellulair drooggewicht, CDW) was 0,681 ± 0,028 gcdwg−1 (n = 3) glycolaldehyde.
bepaling van de SACA-route door celgroei. een celgroei assays gebruikend 0.4 g L-1 glycolaldehyde als aanvullende koolstofbron., B-celgroei assays met behulp van 80 mg L-1 formaldehyde als aanvullende koolstofbron. C celgroei assays met behulp van 8 G L-1 methanol als aanvullende koolstofbron. Cellen werden aanvankelijk gekweekt in lb medium. IPTG werd toegevoegd om eiwituitdrukking te veroorzaken en toen werden de aanvullende koolstofbronnen toegevoegd. OD600 werd gedetecteerd op verschillende tijdstippen., SACA de stam bevat de vector GALS-ACS-PTA-28a, 28a de stam bevat de lege vector van 28a, BsMDH-SACA de stam bevat zowel BsMDH-pCDF als GALS-ACS-PTA-28a vectoren, BsMDH-28a de stam bevat zowel bsmdh-pCDF vector en de lege vector 28a, geen GALS de stam bevat alle genen in de route behalve GALS, + toevoeging van extra koolstofbron, − zonder extra koolstofbron, glycolaldehyde (GALD), formaldehyde (fald), methanol (MEOH). Foutbalken staan voor S. d. (standaarddeviatie), n = 3. Brongegevens worden verstrekt als brongegevensbestand.,
toen we de celgroei testten met formaldehyde als aanvullende koolstofbron, werd de groei van de stam met lege vector volledig geremd door 80 mg L-1 formaldehyde (Fig. 7 ter). De stam met SACA-route werd aanvankelijk geremd en groeide vervolgens normaal op onder dezelfde conditie, die kan worden veroorzaakt door zijn snellere snelheid van formaldehyde consumptie dan de stam met lege vector (aanvullende Fig. 22)., Helaas had de stam die SACA pathway bevatte niet meer biomassa met supplement van formaldehyde dan die zonder formaldehyde. Uit deze resultaten bleek dat de SACA-route weliswaar efficiënter is voor het verwijderen van het toxische formaldehyde, maar niet voldoende is om biomassa te leveren.
eindelijk wilden we de SACA-route evalueren door methanol toe te voeren, dat continu in formaldehyde zou worden omgezet. We vonden dat de stam die zowel BSMDH als SACA route bevat een hogere OD600 heeft dan die controles zonder methanol toevoer of de SACA route (Fig. 7c en aanvullende Fig., 23). Na 26 uur incubatie, vonden we dat de waarde van OD600 in de stam die zowel BsMDH en SACA route nam toe met ongeveer 0,2, wat significant hoger is dan de stam zonder de SACA route (P-waarde = 0,005, t-test). Door te vergelijken met de stam zonder de SACA−route, vonden we dat de hoeveelheid biomassa afgeleid uit methanol 0,03 ± 0,006 gcdw G-1 (n = 3) methanol was in de stam die de SACA-route bevat.