Neste generasjons sekvensering (NGS) metoder som begynte å dukke opp i litteraturen på midten av 2000-tallet, og hadde en transformativ virkning på vår forståelse av mikrobiell genomics og smittsomme sykdommer. Det er likevel betydelig uenighet om hvordan, når og hvor neste generasjons sekvensering vil spille en rolle i den kliniske diagnostiske laboratorier., Et dypdykk point-kontrapunkt diskusjon fra Journal of Clinical Microbiology drøfter de utfordringer og muligheter som kan komme med innføring av metagenomic neste generasjons sekvensering (mNGS) inn i rutine laboratorier. Hva er mNGS og hvordan er det forskjellig fra mange andre nukleinsyre-teknologier der ute?

Hva er Metagenomic Neste Generasjons Sekvensering?

Neste generasjons sekvensering er noen av flere høy-ytelses-sekvensering metoder der milliarder av nukleinsyre fragmenter kan være samtidig og uavhengig av hverandre i rekkefølge., Kontrast denne teknikken til å klassiske metoder som Sanger-sekvensering (også kjent som dideoxynucleotide kjede oppsigelse sekvensering), som behandler ett nukleotid-sekvensen per reaksjon.
for Å karakterisere en bakteriell genom ved hjelp av NGS, for eksempel genom er delt inn i flere fragmenter som produserer sekvenser eller leser alt fra hundrevis til tusenvis av baser i lengden. Sekvensene som er satt sammen til en enkelt genom ved hjelp av beregningsorientert tilnærming. Flere overlappende sekvens leser er satt sammen for å produsere en enkelt lengre sekvens som kalles en contig., Det er ofte avvik mellom contigs og selv om high-fidelity lengre sekvens leser ville være den ideelle metoden for sekvensering, plattformer som produserer kortere leser er vanligvis mindre kostbare og overlapper hverandre i sekvenser gjør dem mer nøyaktige. De bygget genom (sannsynligvis inneholder hull) er justert i forhold til en referanse database for identifisering av organismen. Denne teknologien representerer en betydelig forhånd over de tidlige dagene av sekvensering når en enkelt bakterie-genom-prosjektet kan ta flere år.,
Metagenomic NGS (mNGS) er rett og slett kjører alle nukleinsyre i en prøve, som kan inneholde blandede bestander av mikroorganismer, og tildele disse til deres referanse genomet til å forstå hvilke mikrober er til stede og i hvilke proporsjoner. Evnen til å sekvens og identifisere nukleinsyrer fra flere ulike taksa for metagenomic analyse gjør dette til en kraftig ny plattform som kan samtidig identifisere genetisk materiale fra helt forskjellige riker av organismer.,

Det mulig kliniske anvendelser er enorm, inkludert diagnostikk av smittsomme sykdommer, utbrudd sporing, infeksjon kontroll overvåking, og mutasjon og patogen funn, blant mange andre. mNGS, noen ganger kalt hagle sekvensering, av kliniske prøver har vært anvendt til ulike prøvetypene inkludert spinalvæske, blod, respiratoriske prøver, fordøyelsessystemet væske, og okulær væske.

Hva er Fordelene med Metagenomic Neste Generasjons Sekvensering?,

Den største styrken av mNGS er at det er en interessant hypotese-gratis diagnostisk metode, i motsetning til målrettet polymerase chain reaction (PCR) metoder som er avhengige av primere for identifisering av spesifikke mål å bli forsterket og oppdaget. Selv universal eller bredt utvalg PCR-metoder ikke er tilstrekkelig fleksibelt til å bli vurdert metagenomic, som de bruker spesifikke primere av bevart 16S ribosom-RNA (rRNA) – genet og interne transkribert avstandsstykke (SIN) – sekvenser til å forsterke særegne nukleinsyre-sekvenser som kan være bioinformatically klassifisert i bakterier/archaea, eller sopp henholdsvis.,
Universal primere også utgjøre et problem når du skal diagnostisere polymicrobial infeksjoner med molekylære tester. Hvis polymicrobial bestander er til stede når du bruker sekvensering av 16S, flere base-samtalene vil bli gjort per nukleotid, og produserer en blandet nukleotid chromatogram som ikke kan tolkes. Mens det er de-convolutional computational metoder for å forutsi organismer identifisert, og disse er ikke i vanlig bruk i mange laboratorier, som ofte refleks til neste generasjons sekvensering av 16S genet for polymicrobial prøver.,

Hva er Utfordringene i Metagenomic Neste Generasjons Sekvensering?

til Tross for potensialet i mNGS, det er mange barrierer for å fjerne før teknologien kan bli en del av mainstream laboratorium, samt hull i vår forståelse om sin diagnostiske verktøy. Store bestillinger inkluderer tolkningen av funnene (skille forurensning og kolonisering fra sant patogener), utvalg og validering av databaser brukes for analyse og prediksjon (eller mangel på sådan) av antimikrobielle susceptibilities., En vanlig oppfatning er at mNGS er så utrolig følsom at det vil avsløre en diagnose når alle andre tester er negative. Mens mNGS kan være analytisk mer sensitive enn standard metoder for dyrking i noen tilfeller er det nødvendig fjerning av store mengder av menneskelig nukleinsyre under sekvensering forberedelse og (av beregningsmetoder) under post-analytiske prosessen, kan redusere følsomheten i forhold til målrettede PCR tilnærminger for mange organismer.

spesifisiteten av mNGS forblir den velkjente elefant i rommet., Kontaminering av prøver under prøvetaking er en stor bekymring gitt økt analytiske følsomhet mNGS i forhold til standard kultur metoder, og det må være en godkjent kvalitet-kontroll prosessen i stedet for skritt fra vurdering av reagens renhet på å måle tilstrekkelig genom-dekning kontroller. Videre, med noen Illumina plattformer, feil strekkode indekser kan være utpekt, som fører til falske positiver på sekvensering av data., Bioinformatic kvalitet kontroller er nødvendig for å sikre at høy kvalitet og godkjente genomer er tilgjengelig med minimal database feil, og det skulle ideelt sett være bioinformatic personell tilgjengelig til å tolke sekvensering resultater for hver test, som ikke er tilgjengelig på de fleste kliniske mikrobiologiske laboratorier., Federal Drug Administration (FDA) har samarbeidet med andre føderale organer til å kuratere en database rett FDA-ARGOS (FDA-database for regulerende-klasse mikrobiell sekvenser), som har vært nyttig for å sikre at gjeldende mNGS resultater er pålitelig og nøyaktig, men disse ressursene trenger for å være oppdatert og vedlikeholdt.
Det større spørsmålet er fortsatt rundt klinisk spesifisitet av mNGS: Er det oppdaget sekvenser fra patogener som bidrar til pasientens aktuelle sykdommen?, Den analytiske spesifisiteten av mNGS testing kan møtes med strenge kontroller gjennom prøvetaking, sekvensering bibliotek forberedelse, analysekjøring, og bioinformatic klassifisering, men klinisk spesifisitet er ikke direkte adressert av disse tilnærmingene. Spørsmål som kan hjelpe deg å finne klinisk nytteverdi og anvendbarhet er: Hvordan kan vi skille organismer knyttet til forbigående bakterier fra muntlig/fordøyelsessystemet flora eller hud kolonisatorer i blod/plasma mNGS testing?, Hvordan bør sekvensering dybde rapporteres og hvor pålitelig er forhold som ikke er i rekkefølge dybde true infeksjon? Gjør dette forholdet varierer med patogen/host? Hvor lenge er det forventet synlig half-life av en patogen av mNGS når pasienten får riktig medisinsk behandling? Studier på klinisk nytte og kostnadseffektivitet er sterkt behov for til tross for den uomtvistelige makt av denne teknologien fra et forsknings-og discovery perspektiv.,
Det er også verdt å peke på at det er for tiden ingen FDA-godkjent eller godkjent mNGS tester som kan sendes for mikrobiell testing, selv om det er laboratories sertifisert i henhold til Kliniske Laboratorier Forbedring Endringer av 1988 (CLIA ’88) som tilbyr testing på kliniske prøver. Til dags dato, bare noen få diagnostiske NGS systemer har blitt fjernet av FDA for oncological testing eller påvisning av cystisk fibrose, for eksempel., En fersk gjennomgang beskriver i detalj mange av regulatoriske hindringer og hensyn som må tas opp før mNGS kan angi mainstream kliniske diagnostiske laboratorier som en FDA-godkjent test.
I sammendraget, mens mNGS testing kan trolig spille en viktig rolle i mikrobiologisk diagnostisk arbeidsflyt i framtiden, særlig når sekvensering og bioinformatic prosessorkraft utvikler seg, er dette fortsatt en høy kompleksitet teknologi som klinisk verktøy i vår gjeldende medisinsk praksis miljø er fortsatt usikkert., Selv om mNGS testing kan tilby nye og spennende kliniske diagnostiske muligheter i nær fremtid, ingen av det vil trolig erstatte en slu kliniker når som helst snart.