Design av syntetiske acetyl-CoA sti

Den enkleste måten å syntetisere organisk karbon fra en-karbon er å konstruere det én etter én., For å bygge en kunstig acetyl-CoA vei fra ett karbon, vi foreslo Syntetiske Acetyl-CoA (SACA) vei, der to molekyler av formaldehyd ville bli overført til ett molekyl av acetyl-CoA gjennom bare tre trinn (Fig. 1a). For det første, formaldehyd ville være komprimert i glycolaldehyde (GALD) av glycolaldehyde syntase (JENTER). Og så glycolaldehyde ville bli omdannet til acetyl-fosfat (AcP) av acetyl-fosfat syntase (ACPS) med uorganisk fosfat. Til slutt, AcP ville bli brukt til å produsere acetyl-CoA av kjente enzym fosfat acetyltransferase (PTA)25., I mellomtiden, formaldehyd kan oppnås ved å redusere karbondioksid og formate26 eller oksiderende metan og methanol27. Dermed kunne vi realisere biosyntese av acetyl-CoA fra formaldehyd og andre en-karbon ressurser.

termodynamikk kan reflektere om en vei kan være effektivt utført in vivo eller in vitro. Vi beregnet de termodynamiske kjemiske drivkraften i laget SACA veien., Den generelle reaksjonen fra formaldehyd til acetyl-CoA er svært thermodynamically gunstig, der den totale Gibbs energi-forandring (ΔrG er) av hele reaksjon er om -96.7 kJ mol−1 (Fig. 1b og Supplerende Tabell 1). Verdien av MDF (maksimal drivkraft) er vanligvis brukt til å evaluere den termodynamiske og kinetiske kvalitet av ulike pathways28. Hvis MDF er tilstrekkelig høy, på vei inneholder ingen termodynamiske flaskehalser som vil hemme driften in vivo. Den SACA vei oppnådd relativt høy MDF verdi av 26.,9 kJ mol−1, som er åpenbart høyere enn FLS og MCC trasé (deres MDF verdier er 1,9 og 5.8 kJ mol−1, henholdsvis). Derfor SACA vei er thermodynamically gunstig for biosyntese av acetyl-CoA fra formaldehyd.

Identifisering av en roman enzym fra C1 til C2

kondens av formaldehyd kan være catalyzed av N-heterosykliske carbine i chemistry29,30. I biologi er thiazolium ring av kofaktor tiamin diphosphate (ThDP) har tilsvarende funksjon, som kan aktivere en aldehyd og deretter form dimer med en annen aldehyde31., For å finne et enzym til å kondensere to molekyler av formaldehyd i ett molekyl av glycolaldehyde, vi henvist til katalytisk mekanismer for ThDP avhengige av enzymer og bygget en theozyme modell, som inkluderer ThDP, glycolaldehyde, og glutaminsyre som gir elektron for reaction32 (Fig. 2a). Alle enzymer i Protein Data Bank (PDB) var tilnærmet vist basert på theozyme modell og 37 non-redundant protein strukturer med ligand ThDP ble oppnådd (Supplerende Fig. 1 og Supplerende Notat)., I henhold til katalytisk mekanismer for ThDP-avhengige enzymes33,34,35, C2 atom i ThDP er den aktive center. Avstanden mellom C2 atom og produktet av glycolaldehyde er avgjørende for å utløse den katalytisk reaksjon (Fig. 2a). Dermed, vi har analysert avstand mellom C2 atom og glycolaldehyde i hver kandidat protein.

Basert på den gjennomsnittlige avstander i hvert protein ved hjelp av molekylære docking (Supplerende Data 1)36, seks kandidater med korte avstander og klare funksjonelle kommentarer ble definert som kandidater (Fig. 2b og Supplerende Tabell 2). I tillegg, tre proteiner med lange avstander ble tilfeldig valgt som kontroller. Kandidatene og kontrollene ble uttrykt og renset for å teste deres evne til å produsere glycolaldehyde fra formaldehyd., Tre av seks kandidater utstilt ønsket aktivitet, mens tre kontrollene ikke har den funksjonen, som angir avstand mellom C2 atom og glycolaldehyde spiller en avgjørende rolle på kondens av formaldehyd. Blant tre aktive kandidater, protein 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) som ble betegnet benzaldehyde lyase (BAL), som ble rapportert å fortrinnsvis generere dihydroxyacetone (DHA) på tross av den minimale utbytte av glycolaldehyde når konsentrasjonen av formaldehyd var lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

Ledet utviklingen av glycolaldehyde syntase

Siden BAL hadde vært konstruert for å produsere DHA fra formaldehyde22, vi foreslått å oppdage hvis det tilsvarende mutasjoner i BFD vil også bidra til å bedre enzymaktivitet (Supplerende Fig. 2). Ved screening av alle muterte rester, som vi faktisk funnet en svært aktiv mutasjon W86R-N87T som ble plassert i underlaget kanal av BFD (Supplerende Fig. 3). Derfor er denne mutasjonen (W86R-N87T) ble innført i BFD og den varianten var merket som M1., For å ytterligere forbedre katalytisk aktivitet av BFD, vi foreslått å screene alle rester rundt den aktive midten av BFD, der 25 stillinger innen 8 Å avstand fra den aktive center ble valgt til å gjøre single-point metning mutagenesis (Supplerende Fig. 4). Vi utviklet en høy gjennomstrømning screening tilnærming til å oppdage glycolaldehyde av farge reaksjon mellom glycolaldehyde og diphenylamine, som ble målt ved spectrophotometrically skjerm på 650 nm (Supplerende Fig. 5)., Etter screening, finner vi at 14 av 25 stillinger viste høyere aktiviteter enn M1 mutant (Supplerende Fig. 6). Senere, 14 stillinger ble delt inn i 8 grupper: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378) og H (T379/T380). N27 ble brukt tre ganger siden varianter i denne posisjonen vises den høyeste aktiviteten. Ved hjelp av M1 som mal, vi introdusert hver gruppe av mutasjoner i M1 og valgte det høyeste aktive mutant, som var merket som M2., Ved å utføre tre runder av iterativ kombinatoriske mutagenesis blant disse stillingene, er vi helt skjermet 64,512 kloner og oppnådd en høy aktivitet mutant som inneholder fem roman mutasjoner rundt den aktive center. Til slutt, en variant med 7 rester mutasjoner ble kåret som glycolaldehyde syntase (JENTER). Den kcat av JENTER ble forbedret ca 160-brett og siste katalytisk effektivitet av GALS er 9,6 M−1·s−1, som er omtrent 70-brett enn den begynner enzymet (Fig. 3a og Supplerende Fig. 7).

for å finne ut hvordan disse mutasjonene forbedre enzym aktivitet, vi har foreslått å gjøre om krystallisering av JENTENE. Den aktive lomme finner i grensesnittet av homodimer av GALS38., Protein struktur av GALS kan avvike fra start protein etter flere runder med mutasjon. Her, vi krystalliserte protein av JENTER og hentet krystallstruktur av GALS bruke strukturen av BFD som søk-modellen (Supplerende Tabell 3). Crystal struktur av JENTER ble analysert (Supplerende Fig. 8, Supplerende Fig. 9). Vi fant at mutasjon av L110E introduserer to ekstra hydrogen obligasjoner til hydroksyl gruppe av middels analog (IMA), som kan bidra i å stabilisere transition state og spalte C–C bånd mellom produkt og kofaktor ThDP (Fig. 3b)., Mutasjon av L109G forstørret volumet av substrat bindende lomme ved å bytte ut de store isobutyl gruppe med en hydrogen-gruppen. Den tredje mutasjon av A460M kan justere underlaget og deretter forbedre samspillet mellom ThDP og underlaget. De siste to mutasjoner H281V og Q282F utvidet pore radius på utsiden, og kan tilrettelegge for tilgang til underlaget eller produktet (Fig. 3c). Å sammenligne med M1, volumet av reaksjon lomme i GALS var forstørret mer enn 30%, noe som ville være den viktigste årsaken til forbedringen av katalytisk aktivitet.,

Identifikasjon av acetyl-fosfat syntase

I naturen, ingen enzym som ble rapportert å oppnå syntese av Akp fra glycolaldehyde. Phosphoketolases (PKs) kan produsere AcP fra fruktose-6-fosfat (F6P) eller xylulose-5-fosfat (X5P)39. I henhold til katalytisk mekanisme av PKs, det er mulig at glycolaldehyde samhandler med ThDP og genererer deretter 2-α,β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), som er nøkkelen mellomliggende av forming AcP fra F6P eller X5P av PKs. For å bekrefte vår hypotese, som vi har valgt ut åtte kandidater (Fig., 4b) basert på fylogenetisk tre av PKs fra 111 bakterier familier (Supplerende Fig. 10). Etter genet syntese og protein rensing (Supplerende Fig. 11), undersøkte vi den katalytiske aktiviteten til alle kandidaten proteiner ved hjelp av glycolaldehyde som substrat. Heldigvis, fem av åtte PKs vist betydelig katalytisk aktiviteter. Bare PK1, PK4, og PK8 ikke viser signifikant forskjell fra den tomme kontroll. Dermed PK2 med høyest aktivitet ble betegnet som acetyl-fosfat syntase (ACPS), som kcat/Km oppnår å 3.21 M−1·s−1 (Supplerende Fig. 12).,

for Å avdekke mekanismen for å danne DHEThDP fra glycolaldehyde, vi er invitert til å utføre teoretisk analyse basert på tidligere computational modell av PK40. Alle mulige aminosyrer knyttet til dannelsen av DHEThDP ble brukt til å konstruere computational modell (Supplerende Fig. 13)., Basert på beregningsorientert simulering, fant vi at energi-barriere er bare 11.36 kcal mol−1 for dannelsen av IM1 (intermediate 1) når glycolaldehyde var protonated av His553, som ble ansett som den mest mulig proton donor40 (Fig. 4c). Så, IM1 tautomerizes inn IM2 med hjelp av Glu479 og Glu437. IM2 er energisk mer stabil enn IM1. Når proton av IM2 ble strippet av ved N4′ i ThDP, energi-barriere fra IM2 til viktige mellomliggende DHEThDP er 15.,13 kcal mol−1, som er så likt som den belastning energi under dannelsen av DHEThDP ved hjelp av F6P som substrate40. Etter dannelsen av DHEThDP, følgende katalytiske prosesser er det samme som andre PKs (Supplerende Fig. 14), dvs., H97 fungerer som kalles proton donor av dehydrering prosessen med DHEThDP, og His142 og Gly155 akselerere dehydrering prosessen med DHEThDP, ut fra det faktum at His142 og Gly155 form hydrogen obligasjoner med vann molekyler i struktur av post-dehydrering, middels (AcThDP)., His64, Tyr501, og Asn549 er viktig for nucleophilic angrep av Pi og at de sammen danner bindende nettstedet av Pi39. Site-anvist mutagenesis eksperimenter også indikert at slike rester er avgjørende for enzymaktivitet (Supplerende Fig. 15).

Syntese av acetyl-CoA fra formaldehyd in vitro

Med den første vellykkede design av JENTER og ACPS, vi har til hensikt å konstruere SACA pathway in vitro til å syntetisere acetyl-CoA fra formaldehyd. For det første, vi målte utbyttet av glycolaldehyde av JENTER under forskjellige konsentrasjoner av formaldehyd., Resultatene viste at JENTER kan effektivt å katalysere den dimerization av formaldehyd, og utbyttet av glycolaldehyde økt med konsentrasjonen av substrat forbedret (Fig. 5a). For eksempel, de fleste av glycolaldehyde fra formaldehyd økt fra 45% til 0,5 g L−1 til 80% på 2 g L−1. For det andre, vi undersøkte katalytisk effektivitet fra glycolaldehyde til AcP, som ble kvantifisert ved innholdet av eddiksyre siden AcP ville være raskt redusert til eddiksyre (Supplerende Fig. 16)23., Resultatene viste at utbyttet av AcP nådd mer enn 80% under forskjellige konsentrasjoner av glycolaldehyde via ACPS (Supplerende Fig. 17). Dessverre, ACPS var tydelig hemmet av formaldehyd (Fig. 5b). Derfor er det nødvendig å ta en balanse for konsentrasjonen av formaldehyd i å løse denne konflikten.

for å optimalisere konsentrasjonen av formaldehyd, en gradient eksperiment ble utført ved hjelp av reaksjonen system som inneholder 2 mg mL−1 for JENTER og ACPS. Med økende konsentrasjonen av formaldehyd, utbyttet av eddiksyre i systemet i utgangspunktet økt, og deretter redusert (Fig. 5c). Når konsentrasjonen av formaldehyd er 1 g L−1, utbyttet av eddiksyre nådd 50.6%., Det er interessant at den endelige utbytte av eddiksyre er enda høyere enn det i reaksjonen system fra glycolaldehyde til AcP med samme mengde formaldehyd (Fig. 5b, grå linje). Dette ville være forårsaket av delvis frigjørende funksjon av ACPS siden formaldehyd ble gradvis fortært av JENTENE. Basert på dette systemet, har vi videre lagt til en annen kjent enzym fosfat acetyltransferase (PTA), som ville konvertere AcP til acetyl-CoA. Til slutt, SACA vei produsert 5,5 mM acetyl-CoA i formaldehyd konsentrasjon av 1 g L−1. Utbyttet av acetyl-CoA fra formaldehyd var i ferd med 33% (Fig. 5d)., Imidlertid, avkastningen av eddiksyre (7,8 mM) fra formaldehyd (33.3 mM) er nådd til 50% hvis PTA og CoA ikke ble levert. Den lavere avkastning av acetyl-CoA enn eddiksyre ville være forårsaket av ustabilitet av acetyl-CoA og AcP. Våre resultater viser at det er vellykket for biosyntese av acetyl-CoA fra formaldehyd av SACA pathway in vitro.,

Validering av SACA vei av 13C-merking

Etter å bringe på det rene den SACA veien med rensede enzymer in vitro, vi videre forsøkt å teste biosyntese av acetyl-CoA, og det er derivater fra SACA pathway in vivo av 13C-metabolske sporing analyser (Fig. 6a). For det første, celle lysates ble brukt til å bekrefte biosyntese av acetyl-CoA med tillegg av 13C-merket formaldehyd og CoA. Vi oppdaget betydelig økning av den doble 13C-merket acetyl-CoA enn andre kontroller (P-verdi < 0.001, T-test) (Fig. 6b og Supplerende Fig. 18)., Videre økning av dobbel 13C-merket acetyl-CoA forsvant hvis vi utelatt en av gener i SACA veien som ACPS og PTA (Supplerende Fig. 19). I tillegg, acetyl-CoA ville være konvergerte med oxaloacetate å angi tricarboxylic syre (TCA) syklus. Vi oppdaget også betydelig mer double 13C-merket fumarate (P-verdi < 0.001, T-test) og malate (P-verdi < 0.001, T-test) bare i belastningen med SACA vei og 13C-merket formaldehyd fôring (Fig. 6b og Supplerende Fig. 18)., Men gjorde vi ikke finner signifikante forskjeller i høyere for masse isotopomers. Det ville være forårsaket av den lave mengden av dobbel 13C-merket isotopomers i TCA-syklus.

Senere, vi foreslått å teste karbon flyt i cellene. På grunn av giftigheten av formaldehyd til celler, vi introduserte metanol dehydrogenase fra Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 for å opprettholde en kontinuerlig lav konsentrasjon av formaldehyd i vivo (Fig. 6a). De dyrket cellene ble høstet på ulike tidspunkt poeng og ble brukt til å oppdage proteinogenic aminosyrer og intracellulære metabolitter (Fig. 6c)., Vi fant at belastningen med SACA vei (BsMDH-SACA) inneholdt flere doble 13C-merket aspartat og glutamat, som er avledet fra TCA-syklus. I tillegg, 13C-merket glukose og phosphoenolpyruvate, som kan generere fra double 13C-merket oxaloacetate gjennom gluconeogenesis vei, ble det oppdaget flere i belastning BsMDH-SACA enn de som er i kontroll-belastning (BsMDH-28a). Dermed våre resultater viser at SACA vei er funksjonelle for produksjon av acetyl-CoA og acetyl-CoA-avledet metabolitter fra formaldehyd.,

Evaluering av SACA veien for celle vekst

for ytterligere å vurdere SACA vei i vivo, vi er invitert til å teste celle vekst stegvis ved å fôre hver mellomliggende på veien. I utgangspunktet E. coli vokste opp under middels rik og så glycolaldehyde ble lagt til som supplerende karbon kilde. Ved å legge til forskjellige konsentrasjoner av glycolaldehyde (Supplerende Fig. 20), finner vi at den optimale belastningen som inneholder SACA vei med mer enn 0.,4 g L−1 glycolaldehyde tilbudet har bemerkelsesverdig høyere OD600 enn de som stammer uten glycolaldehyde eller SACA veien (Fig. 7a og Supplerende Fig. 21). Bidraget av glycolaldehyde til biomasse (mobil tørr vekt, CDW) var 0.681 ± 0.028 gCDWg−1 (n = 3) glycolaldehyde.

Når vi testet cellevekst ved bruk av formaldehyd som supplerende karbon kilde, veksten av belastningen med tom vektor var helt hemmet av 80 mg L−1 av formaldehyd (Fig. 7b). Belastningen inneholder SACA veien ble hemmet først, og deretter vokste opp som normalt under samme tilstand som kan være forårsaket av dens raskere formaldehyd forbruk enn belastningen med tom vektor (Supplerende Fig. 22)., Dessverre belastningen inneholder SACA veien ikke har mer biomasse med supplement av formaldehyd enn de uten formaldehyd. Disse resultatene indikerte at selv om det SACA vei er mer effektiv for å fjerne giftige formaldehyd, det er ikke nok til å gi biomasse.

I det siste, vi har til hensikt å evaluere SACA veien ved fôring metanol, som ville være kontinuerlig konvertert til formaldehyd. Vi fant at belastningen som inneholder både BsMDH og SACA veien har høyere OD600 enn de som styrer uten metanol tilførsel eller SACA veien (Fig. 7c og Supplerende Fig., 23). Etter 26 timers inkubering, fant vi at verdien av OD600 i belastning som inneholder både BsMDH og SACA sti økt ca 0,2, som er betydelig høyere enn den belastning uten SACA vei (P-verdi = 0.005, T-test). Ved å sammenligne med belastning uten SACA vei, fant vi ut at mengden biomasse som er avledet fra metanol var på 0,03 ± 0.006 gCDW g−1 (n = 3) metanol i belastning som inneholder SACA veien.