Den genetiske forbindelser mellom DNA-reparasjon av veier og menneskelig kreft predisposisjon har drevet interesse i proteiner som gjenkjenner og reparerer spesifikke områder av DNA-skade. Reparasjon enzymer er bemerkelsesverdig bevart fra bakterier til sopp til mennesker, og understreker premium plassert på å opprettholde genom integritet i møte med en mutagene byrde., DNA er utsatt for skader forårsaket av feil som er begått under replikasjon og av miljømessige faktorer, som for eksempel stråling, oksidanter, eller alkylerende stoffer. Reparasjon reaksjoner innebære eksisjon av kjemisk endret eller mispaired baser fra DNA-dupleks. Resulterende hullene er fylt i av DNA polymerases; denne reaksjonen etterlater et nick på eller flankerer stedet for reparasjon. En tilsvarende prosess som oppstår i løpet av kromosomale DNA replikasjon, der 5′-RNA segmenter som prime usammenhengende syntese av Okazaki-fragmenter er excised, og de mellomliggende hullene er fylt ut av DNA-polymerase.,

DNA-reparasjon og replikering veier møtes på en felles siste trinn i som kontinuitet i den reparert DNA strand er restaurert av DNA ligase, et enzym som omdanner hakk i phosphodiester obligasjoner. Nicks er potensielt skadelige DNA-lesjoner som, hvis den ikke blir korrigert, kan gi opphav til dødelige dobbel-strand pauser. Følgelig er det totale tapet av DNA ligase funksjon er dødelig.

DNA Ligase Reaksjon

DNA ligases katalysere til å bli med på en 5′-fosfat-avsluttet strand til en 3′-hydroksyl-avsluttet strand., Ligation avhenger av magnesium og en høy-energi kofaktor, enten ATP eller NAD+. Reaksjonen mekanismen innebærer 3 sekvensiell nucleotidyl overføre reaksjoner. I det første trinnet, nucleophilic angrep på alpha-fosfor av ATP (adenosin trifosfat) eller NAD+ (nikotinamid adenine dinucleotide) av ligase resulterer i utslipp av pyrophosphate eller NMN (nikotinamid mononucleotide) og dannelsen av en covalent middels (ligase-adenylate) i hvilken FORSTERKER er koblet via en phosphoamide (P-N) bånd til epsilon-amino gruppen av en lysin., I det andre trinnet, AMP er overført til 5′-enden av 5′-fosfat-avsluttet DNA-strand for å danne DNA-adenylate — en omvendt pyrophosphate bro struktur, AppN. I denne reaksjonen, 5′-fosfat oksygen i DNA-strand angrep fosfor av ligase-adenylate; aktiv-området lysin side kjeden er å forlate gruppen. I det tredje trinnet, ligase catalyzes angrep fra 3′-OH av nick på DNA-adenylate til å bli med på 2 polynucleotides og frigjøre AMP.

Fylogenetisk Distribusjon

Levende organismer består av 3 domener: eubacteria, archaeabacteria, og eukaryotes., Alle organismer kode 1 eller flere DNA-ligases. Den ligases er gruppert i 2 familier, ATP-avhengige ligases og NAD+-avhengige ligases, i henhold til nukleotid substrat som kreves for ligase-adenylate dannelse. ATP-avhengige DNA ligases finnes i alle 3 domener. NAD+-avhengige DNA ligases (LigA) er allestedsnærværende i bakterier, der de er helt nødvendige for vekst og presentere attraktive mål for anti-infective drug discovery. NAD+-avhengige ligases er oppstått bare sporadisk utenfor bakteriell domenet av livet, f.eks., i halophilic archaea og bestemte DNA-virus, og var antagelig kjøpt i disse taksa av horisontale gene transfer.

Eukaryote Mobil ATP-avhengige Ligases

ATP-avhengige DNA ligases finnes i alle eukaryote arter. Mammalske celler inneholder fire DNA-ligase isozymes. Aminosyre-sekvensen sammenligninger tyder på at en kjerne katalytisk domene som er felles for alle ATP-avhengige ligases er pyntet med ekstra isozyme-spesifikke domener ligger på amino eller carboxyl termini av proteiner., Det er antatt at disse flankerer segmenter megle binding av nukleære DNA ligases til andre proteiner involvert i DNA-replikasjon, reparasjon, og rekombinasjon. Hos pattedyr isozymes er referert til som ligase jeg, ligase IIIa, ligase IIIb, og ligase IV. DNA ligase jeg er en 919-amino acid polypeptid, uttrykt i alle vev, som catalyzes det nye medlemmet av Okazaki-fragmenter under DNA replikasjon og spiller også en rolle i DNA-reparasjon., DNA ligases IIIa (922 aminosyrer) og IIIb (862 aminosyrer) er produkter av et enkelt gen, de skiller seg i aminosyresekvens bare på deres carboxyl termini som en konsekvens av alternativ mRNA spleising. Ligase IIIa er uttrykt ubiquitously og er involvert i DNA-reparasjon, og er avgjørende for mitokondrienes funksjon. Ligase IIIb uttrykket er begrenset til å testis, spesielt for å spermatocytes gjennomgår meiose. DNA ligase IV er en 911-amino acid polypeptid som spiller en rolle i reparasjon av dobbel-strand DNA pauser via ikke-homologe slutt å bli med (NHEJ).,

gjærceller inneholder 2 separat kodet av DNA ligases, som er homologe til pattedyr DNA ligases i og IV, henholdsvis. DNA-ligase jeg (Cdc9p) av den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae er viktig for celle vekst. Genetiske eksperimenter impliserte ligase jeg i forsegling Okazaki-fragmenter og i gjennomføring av DNA-eksisjon reparasjon. I kontrast, gjær DNA ligase IV er ikke avgjørende for celle vekst. Imidlertid, sletting av LIG4 genet utløser phenotypes som indikerer at ligase IV catalyzes reparasjon av dobbel-strand pauser i ikke-homologe slutt å bli med veien (NHEJ)., Spirende gjær har tilsynelatende ingen homologue av nukleære DNA ligase III.

Viral ATP-Avhengige DNA Ligases

Bakteriell DNA-virus, for eksempel E. coli bakteriofager T4, T6, T7, og T3, kan kode sin egen ATP-avhengige DNA ligases. ATP-avhengige DNA ligases er også kodet av eukaryote DNA-virus som driver noen eller alle av sine replikering syklus i cytoplasma. Disse inkluderer vaccinia virus, Afrikansk svin feber virus, og Chlorella virus PBCV1. Den bacteriophage og eukaryote viral DNA ligases er mindre enn sin mobiltelefon kolleger., Vaccinia DNA ligase, et 552-amino acid polypeptid, er påfallende lik i aminosyre-sekvensen nivå for å mammalske DNA ligase III. Faktisk, ligase III er mer nært knyttet til vaccinia ligase enn å mammalske ligases i og IV. Den ligases av T4 (487 aminosyrer), T7 (359 aminosyrer), T3 (346 aminosyrer), og Chlorella virus (298 aminosyrer) er mindre fortsatt. Vi har vist at Chlorella virus ligase kan utfylle vekst av gjær belastning som DNA ligase jeg genet har blitt slettet., Dette resultatet tyder på at protein segmenter som er unike for den mye større DNA ligase jeg er ikke avgjørende for gjær cellevekst.

Nick-Sensing av DNA Ligases

Vi har undersøkt samspillet av eukaryote ligases med DNA ved hjelp av virus-kodet enzymer som modeller. Vaccinia virus DNA ligase og Chlorella virus DNA ligase hver form en diskret kompleks med en enkeltvis hakket DNA-ligand i fravær av magnesium som kan bli løst fra gratis DNA av innfødte polyakrylamid gel elektroforese., Viral ligases ikke danner stabile komplekser med følgende ligander: (i) DNA som inneholder en 1-nukleotid eller 2-nukleotid gap; (ii) den forseglede tosidig DNA-produkt av ligation reaksjon; (iii) en enkeltvis hakket tosidig inneholder en 5′-OH terminus på nick i stedet for 5′-fosfat; eller (iv) en enkeltvis hakket tosidig inneholder en RNA-tråd på 5′-fosfat siden av nick (10 til 15). Dermed viral ATP-avhengige DNA ligases har en iboende nick-sensing funksjon.,

Nick anerkjennelse av vaccinia DNA ligase og Chlorella virus DNA ligase avhenger også av personer av AMP bindende lomme på enzym — dvs., mutasjoner av ligase aktivt nettsted som avskaffe kapasitet til å danne ligase-adenylate mellomliggende også eliminere nick anerkjennelse, mens en mutasjon som bevarer ligase-adenylate-formasjonen, men inaktiverer nedstrøms trinnene i strand begynte reaksjon har ingen effekt på binding til hakkete DNA., Beslaglegging av en extrahelical nukleotid av DNA-bundet ligase minner om «base-flipping» mekanisme av målområde anerkjennelse og katalyse brukes av andre DNA-modifisering og reparasjon av enzymer.

Selv om de 5′-fosfat fraksjonen er viktig for binding av Chlorella virus ligase å hakkete DNA, 3′-OH fraksjonen er ikke nødvendig for nick anerkjennelse. Chlorella virus ligase binder seg til en hakkete ligand inneholder 2′, 3′ dideoxy og 5′-fosfat termini men ikke kan katalysere adenylation av 5′-enden., Dermed, 3′-OH er viktig for trinn 2 kjemi, selv om det er ikke i seg selv kjemisk omdannet under DNA-adenylate dannelse.

for Å avgrense den ligase-DNA-grensesnitt, vi footprinted den ligase bindende nettstedet på DNA. Størrelsen på exonuclease III fotavtrykk av ligase bundet til en enkelt nick i duplex-DNA er 19 til 21 nukleotider. Fotavtrykket er asymmetrisk, som strekker seg 8 til 9 nukleotider på 3′-OH-siden av nick og 11 til 12 nukleotider på 5′-fosfat side.,

krystallstruktur av Eukaryote DNA Ligase-Adenylate

Chlorella virus DNA ligase (ChVLig) er den minste eukaryote ATP-avhengige ligase kjent. Som «minimal» DNA ligase, det presentert et attraktivt mål for strukturbestemmelse. Vi krystallisert ChVLig og bestemt dens struktur på 2 ➀ oppløsning. Enzymet består av en større N-terminal nucleotidyltransferase (NTase) domene og en mindre C-terminal OB domene med en kløft mellom dem. En FORSTERKER fraksjonen var kovalent bundet til Nz av Lys27 på den aktive siden., Dermed, vi har strukturen av en ekte katalytisk middels.

Innenfor NTase domene er en adenylate bindende lomme består av seks peptid motiver (I, Ia, III, IIIa, IV og V) som definerer covalent nucleotidyltransferase enzym superfamily som inneholder DNA og RNA ligases og mRNA tildekking enzymer. Motiv jeg (KxDGxR) inneholder lysin som FORSTERKER blir kovalent bundet i første trinn av ligase reaksjon. Aminosyrer i motiver Ia, III, IIIa, IV og V-kontakt, FORSTERKER og spille viktige roller i ett eller flere trinn av ligation veien., Den OB-domenet består av en fem-strandet antiparallel beta fat pluss en alpha helix.

Strukturelle Grunnlag for Nick Anerkjennelse av en Minimal «Pluripotente» DNA ligase

Selv om ChVLig mangler den store N – eller C-terminal flankerer domener finnes i eukaryote cellulær DNA ligases, det kan opprettholde mitotic vekst, DNA-reparasjon, og nonhomologous slutt å bli med i spirende gjær når det er den eneste kilden til ligase i cellen. ChVLig kan selv utføre viktige funksjoner av nukleære Lig3 i mitokondrie DNA-metabolisme., Vi foreslått at ChVLig representerer en nedstrippet «pluripotente» ligase på grunn av sin iboende nick sensing funksjon, på grunnlag av det som ble opplyst da vi løste 2.3 Å krystallstruktur av ChVLig-FORSTERKER, som er bundet til et 3′-OH/5′-PO4 nick i duplex-DNA.

ChVLig omkranser DNA som en C-formet protein klemme. Den NTase domene binder seg til den ødelagte og intakt DNA-tråder i major groove flankerer nick, og også i de mindre groove på 3′-OH-siden av nick. Den OB domene binder seg over mindre sporet på overflaten av tosidig bak nick., En roman «latch» modul – bestående av en beta-hårnål sløyfe som springer ut fra OB domene – opptar store groove og fullfører omkrets klemme via kontakter mellom tuppen av loopen og overflaten av NTase domene. Låsen er avgjørende for klemmen lukking og er en viktig determinant av nick sensing.

Sammenligning av krystallstrukturer av gratis og nick-bundet ChVLig-AMP avslører et stort domene rearrangements tilhørende nick anerkjennelse., I gratis ChVLig-AMP, den OB-domenet er reflektert bort fra NTase domenenavn å bli utsett DNA-bindende overflaten over AMP-bindende lomme. Peptid-segmentet som er forutbestemt til å bli en latch er uryddig i gratis ligase og følsom for protolyse. Men dette segmentet er beskyttet mot protolyse når ChVLig binder seg til hakkete DNA. DNA-bindende innebærer en nesten 180 rotasjon av OB domene rundt en sving, slik at den konkave overflaten av OB beta tønne passer inn i DNA mindre sporet., Denne overgangen utløser en 63 Å bevegelsen av OB domene og steder låsen dypt i DNA major groove.

Et nettverk av interaksjoner med 3′-OH-og 5′-PO4 termini i det aktive området opplyst DNA adenylylation mekanisme og avgjørende roller på FORSTERKEREN i nick-sensing og katalyse. Tillegg av en divalent cation utløst nick tetting i crystallo, og dermed etablere at nick komplekse er en bona fide middels i DNA reparasjon veien.,

– Struktur av NAD+-avhengige DNA Ligase bundet til å Hakkete DNA-adenylate

NAD+-avhengige DNA ligases (referert til som LigA) er en særegen og strukturelt homogen clade av enzymer som finnes i alle bakterier. E. coli LigA (671-aa) er prototypen på denne familien. LigA har en modulær arkitektur som er bygd rundt en sentral ligase kjernen består av en NTase domene og en OB-domenet. Kjernen er flankert av en N-terminal «Ia» domene og tre C-terminal moduler: en tetracysteine zink-finger, en helix-hårnål-helix (HhH) domene og en BRCT domene., Hvert trinn av ligation vei er avhengig av en annen undergruppe av LigA domener, med bare NTase domenet er nødvendig for alle trinn. Domenet Ia er unik NAD+-avhengige ligases, er ansvarlig for bindende NMN fraksjonen av NAD+, og er nødvendig for reaksjon med NAD+ for å danne ligase-AMP middels.

Vi har funnet at NAD+-avhengige E. coli DNA ligase kan støtte veksten av Saccharomyces cerevisiae stammer slettes enkeltvis for CDC9 eller dobbelt for CDC9 pluss LIG4., Dette er den første demonstrasjonen som en NAD+-avhengige enzym er biologisk aktive i en eukaryote organismen. Senere studier (i samarbeid med Maria Jasin) viste at E. coli LigA kunne være tilstrekkelig for ligase funksjon i mus ES celler som mangler essensielle Lig3 enzym.

Vår krystallstruktur av E. coli LigA bundet til hakkete DNA-adenylate middels åpenbart at LigA også omkranser DNA-spiral som en C-formet protein klemme. Protein-DNA-grensesnitt innebærer omfattende DNA-kontakter ved NTase, OB, og HhH domener over en 19-bp segment av tosidig DNA-sentrert om nick., Den NTase domene binder seg til ødelagt DNA-tråder på, og flankerer nick, den OB domene kontakter kontinuerlig mal strand rundt nick, og HhH domene binder både tråder på tvers av de mindre groove i periferien av fotavtrykket. Den Zn-finger-modulen spiller en strukturell rolle i å bygge bro mellom OB og HhH-domener. Domenet Ia gjør ingen kontakter til DNA-duplex, i samsvar med sin dispensability for katalyse av strand avslutning på en AppDNA underlaget.,

LigA NTase og OB-domener er plassert på samme måte på DNA omkretsen til NTase og OB domener av ATP-avhengige DNA ligases, og de «fotavtrykk» som ligner segmenter av DNA-tråder. Men topologi av LigA klemmen er tydelig forskjellig fra de klemmer dannet av ChVLig og menneskelig DNA ligase 1 (HuLig1, bestemmes av Tom Ellenberger og kolleger). Kyssingen kontakter som nær LigA klemmen er sui generis, som involverer NTase domene og C-terminal HhH domene., Basert på tilgjengelig strukturelle data, er det klart at DNA ligases har utviklet seg minst tre forskjellige virkemidler for å omringe DNA.

Sammenligninger av E. coli LigA—AppDNA kompleks med strukturer av andre bakterielle ligases tatt som binære LigA•—NAD+ kompleks (trinn 1 substrat), binære LigA•—NMN komplekse (post-trinn 1 forlater gruppen), og covalent ligase-AMP viderekommende (trinn 1 produkt etter at han forlot gruppen dissosiasjon) uthev massive protein domene rearrangements (på ordre fra 50 til 90➀) som oppstår i takt med substrat-bindende og katalyse., DNA-bindende og klemme dannelse av LigA innebærer en nesten 180 rotasjon av OB-domenet slik at den konkave overflaten av OB beta fat som passer i mindre groove, lik det som er sett eller avledet for ChVLig og HuLig1. De fire-punkts binding av HhH-domenet i periferien av LigA-DNA fotavtrykk stabilisert en DNA-bend sentrert på nick. LigA-DNA vekselsvirkningene umiddelbart flankerer nick indusere en lokal DNA forvrengning, noe som resulterer i adopsjon av et RNA-som En form helix, igjen som et ekko av funnene for HuLig1-DNA cocrystal.,

Mekanisme av lysin adenylylation av ATP-avhengige og NAD+-avhengige polynucleotide ligases

auto-adenylylation reaksjon av polynucleotide ligases er utført av en nucleotidyltransferase (NTase) domene som er bevart i ATP-avhengige DNA og RNA ligases og NAD+-avhengige DNA ligases. Den NTase domenet innebærer å definere peptid motiver som danner nukleotid-bindende lomme. Motiv jeg (KxDG) inneholder lysin som blir kovalent bundet til AMP. Som Robert Lehman påpekt i 1974, og det er uklart hvordan lysin (med et anslått pKa-verdi på ~10.,5) mister sin proton ved fysiologisk pH for å oppnå unprotonated staten som kreves for angrep på α fosfor av ATP eller NAD+. I prinsippet ligase kan ansette en generell base for å deprotonate den lysin. Alternativt, pKa kunne bli kjørt ned av positiv ladning potensial av protein aminosyrer rundt lysin-Nz. Flere krystallstrukturer av ligases fraværende metaller gitt lite støtte for enten forklaring. I disse strukturene, motif jeg lysin nucleophile ligger ved siden av et motiv IV glutamat eller aspartat side kjede., Den lysin og motiv IV kaliumcarboxylaat danne en ion-par, er den forventede effekten av disse er å øke pKa av lysin i kraft av omkringliggende negativ ladning. Det er usannsynlig at en glutamat eller aspartat anion kunne tjene som generelle base for å abstrakte en proton fra lysin kasjon. En mulig løsning ville være hvis en divalent cation abuts lysin-Nz og kjører ned sin pKa.,

En metall-drevet mekanismen ble avslørt av våre siste krystallstruktur av Naegleria gruberi RNA-ligase (NgrRnl) som et trinn 1 Michaelis-kompleks med ATP og mangan (den foretrukne metall kofaktor). Nøkkelen til å fange Michaelis-som kompleks var utskifting av lysin nucleophile av en isosteric metionin. 1,9 Å struktur finnes ATP og to mangan ioner i det aktive området. Den «katalysator» metal var koordinert med oktaedrisk geometri til fem vatn, som var i sving, som koordineres av kaliumcarboxylaat sidekjeder av bevart rester i motiver i, III, og IV., Den sjette ligand-området i katalytisk metall komplekset ble okkupert av en ATP α fosfat oksygen, en indikasjon på en rolle for metall i å stabilisere den overgangen state of the auto-adenylylation reaksjon. En viktig innsikt, befestet av superposisjon av Michaelis-kompleks på strukturen covalent NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP middels opptatt av rollen som katalysator metall komplekse i å stabilisere den fn-protonated tilstand av lysin nucleophile før katalyse, via lokale positiv ladning og atomic kontakt av Lys-Nz til en av metal-bundet vann., Den NgrRnl Michaelis komplekse avslørt et annet metall, koordinert octahedrally til fire farvann og til ATP β-og γ-fosfat oxygens. Metall komplekse og ATP-γ-fosfat var engasjert av et ensemble av aminosyren side kjeder (som er unike for NgrRnl) som til sammen orientere PPi å forlate gruppen apical til lysin nucleophile. I samsvar med en single-trinn i-linje mekanisme, α fosfat var stereochemically invertert ved overgang fra NgrRnl•ATP Michaelis komplisert å lysyl–AMP middels.,

DNA ligases er antatt å ha utviklet seg separat fra RNA ligases, først ved fusjon av en forfedres ATP-utnytte NTase domene til en C-terminal OB domene (skal omfatte minimal katalytisk kjernen av en DNA-ligase), og senere via fusjon av flere strukturelle moduler til NTase-OB core (7). NAD+-avhengige DNA ligases (LigA enzymer), som er allestedsnærværende i bakterier og avgjørende for bakteriell levedyktighet, ervervet sine spesifisitet for NAD+ via fusjon av en NMN-bindende Ia domene-modulen for å N-terminus av NTase domene., Escherichia coli DNA ligase (EcoLigA) var den første cellulær DNA ligase oppdaget og karakterisert og det er fortsatt den fremste modell for strukturelle og funksjonelle studier av NAD+-avhengige DNA ligase familie. Interesse i LigA mekanismen er drevet av løftet av målretting LigA (via sin signatur NAD+ substrat spesifisitet og unike strukturelle har vis-à-vis menneskelig DNA ligases) for anti-bakteriell stoff-funnet.

Vi løst et 1.55 Å krystallstruktur av EcoLigA som en Michaelis-kompleks med NAD+ og magnesium., Strukturen avslører et en-metall mekanisme der en ligase-bundet Mg2+(H2O)5 kompleks senker lysin pKa og engasjerer NAD+ α fosfat, men β fosfat og nikotinamid nucleoside av NMN å forlate gruppen er orientert utelukkende via atomic interaksjoner med protein elementene som er unike for LigA clade. De to-metall (for ATP-avhengige ligase) versus en-metall (for NAD+-avhengige ligase) dikotomi avgrenser en branchpoint i ligase evolusjon.