자의 합성 acetyl-CoA 통

하는 가장 간단한 방법은 합성 유기 탄소서 한탄소를 구성하는 것 그것이 하나 하나입니다., 하기 위해 구축이 인공 acetyl-CoA 경로 중 하나에서는 탄소,우리는 제안합성 Acetyl-CoA(SACA)경로는 두 개의 분자의 포름알데히드가 될 것으로 전송 하나의 분자 acetyl-CoA 을 통해서만 세 가지 단계는(그림. 1a). 첫째,포름 알데히드는 글리콜 알데히드 신타 제(GAL)에 의해 글리콜 알데히드(GALD)로 응축된다. 그리고 나서 글리콜 알데히드는 무기 인산염을 사용하여 아세틸-포스페이트 신타 제(ACPS)에 의해 아세틸-포스페이트(AcP)로 전환 될 것이다. 마지막으로,AcP 는 알려진 효소 포스페이트 아세틸 트랜스퍼 라제(pta)25 에 의해 아세틸-CoA 를 생산하는데 사용될 것이다., 한편,포름 알데히드는 이산화탄소와 formate26 을 줄이거 나 메탄과 methanol27 을 산화시켜 얻을 수 있습니다. 따라서,우리는 포름 알데히드 및 심지어 다른 하나의 탄소 자원으로부터 아세틸-CoA 의 생합성을 실현할 수 있었다.

열역학을 반영할 수 있는지 여부는 통로이 될 수 있을 효과적으로 수행된 생체 내에서 또는 체외. 우리는 설계된 SACA 경로의 열역학적 화학적 원동력을 계산했습니다., 전체적인 반응에서 포름알데히드 acetyl-CoA 높은 열역학적으로 유리한,총 Gibbs 에너지경(ΔrG’m)의 전체 반응에 대해 -96.7kJ mol−1(Fig. 1b 및 보충 표 1). MDF(최대 구동력)의 값은 일반적으로 다른 pathways28 의 열역학적 및 운동 품질을 평가하는 데 사용됩니다. MDF 가 충분히 높으면 통로는 생체 내에서 작동을 방해하는 열역학적 병목 현상을 포함하지 않습니다. SACA 경로는 비교적 높은 mdf 값 26 을 얻었습니다.,9kJ mol-1 은 fls 및 MCC 경로보다 분명히 높습니다(MDF 값은 각각 1.9 및 5.8kJ mol−1 입니다). 따라서,saca 경로는 포름 알데히드로부터 아세틸-CoA 의 생합성에 열역학적으로 유리하다.

의 식별을 소설은 효소에서 C1-C2

응축의 포름알데히드할 수 있습에 의해 촉매 N-헤테로고리병에 chemistry29,30. 생물학에서의 thiazolium 반지의 cofactor 티아민의 인산(ThDP)비슷한 기능을 활성화할 수 있습 중 하나는 알데하이드 및 다음 형태로 이합체로 다른 aldehyde31., 를 찾기 위해서는 효소를 응축하는 두 개의 분자의 포름알데히드 중 하나로 분자의 glycolaldehyde,우리라고 촉매 메커니즘의 ThDP 의존하는 효소 및 건설 theozyme 모델을 포함하는 ThDP,glycolaldehyde 및 글루타민산 산성을 제공하는 전자에 대한 reaction32(Fig. 2a). 모든 효소에서는 단백질의 데이터 은행(PDB)었다는 사실상으로 심사 theozyme 모델 37 비중복 단백질 구조과 리간드 ThDP 달성했다(보충 Fig. 1 및 보충 참고 사항)., ThDP 의존성 효소의 촉매 메커니즘에 따르면 33,34,35,ThDP 의 C2 원자는 활성 중심이다. C2 원자와 글리콜 알데히드의 생성물 사이의 거리는 촉매 반응을 유발하는 데 중요합니다(그림 1). 2a). 따라서,우리는 각 후보 단백질에서 C2 원자와 글리콜 알데히드 사이의 거리를 분석했다.

평균을 기준으로 거리에서 각각의 단백질을 사용하여 분자 도킹(추가 데이터는 1)36,여섯 후보로 짧은 거리를 명확한 주석 기능으로 정의되었 후보자(Fig. 2b 및 보충 표 2). 또한,장거리를 가진 3 개의 단백질이 무작위로 대조군으로 선택되었다. 후보자와 대조군은 포름 알데히드로부터 글리콜 알데히드를 생산하는 능력을 시험하기 위해 발현되고 정제되었다., 세 가지의 여섯 후보 전시에 원하는 활동을 제어 있지 않은 기능,사이의 거리를 나타내는 C2 원자와 glycolaldehyde 중요한 역할을에서의 응축 포름알데히드도 있습니다. 세 가지 중에서 활동 후보자,단백질 2UZ1(https://www.rcsb.org/structure/2UZ1)는 것이라고 불 벤즈알데히드 lyase(BAL),보고되었을 우선적으로 생성 dihydroxyacetone(DHA)에도 불구하고의 최소한의 수익률 glycolaldehyde 경우 농도의 포름알데히드었 lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

지시 진화의 glycolaldehyde synthase

이후 발었 설 DHA 에서 formaldehyde22,우리가 제안을 감지하는 경우에는 해당에서 돌연변이 BFD 또한 것을 향상에 기여하는 효소 활동(보충 Fig. 2). 스크리닝으로 모든 변 잔류물,우리는 사실을 발견 매우 활성 돌연변이 W86R-N87T 던에 위치한 기판의 채널 BFD(보충 Fig. 3). 따라서이 돌연변이(W86R-N87T)가 BFD 에 도입되었고 변형은 M1 로 표시되었다., 기 위해서는 더욱 향상된 촉매 활동의 BFD,우리가 제안 화면으로 모든 잔류물 주위에 활성 중심의 BFD,25 위치에서 8Å 거리에 활성 중심을 선택했 single-point saturation mutagenesis(보충 Fig. 4). 우리는 높은 처리량 검사 방법을 감지하는 glycolaldehyde 색상으로 사이의 반응 glycolaldehyde 및 diphenylamine 되었으로 측정 spectrophotometrically 모니터링에서 650nm(보충 Fig. 5)., 선별 검사 후,우리는 25 개 위치 중 14 개가 M1 돌연변이 체보다 높은 활성을 나타냄을 발견했다(보충 도 2). 6). 이어서,14 개의 포지션을 8 개의 그룹으로 나누었다:A(N27/G402),B(N27/S236),C(N27/A460),D(F397/C398),E(L109/L110),F(H281/Q282),G(N374/S378),및 H(T379/T380). 이 위치의 변형이 가장 높은 활동을 나타 내기 때문에 n27 을 세 번 사용했습니다. M1 을 템플릿으로 사용하여 각 돌연변이 그룹을 M1 에 도입하고 M2 로 표시된 가장 높은 활성 돌연변이 체를 선택했습니다., 에 의해 수행하는 세 가지 라운드의 반복적인 조합 mutagenesis 이러한 가운데 위치,우리가 완전히 가려 64,512 복제 및 얻은 높은 활동을 돌연변이 포함한 다섯 개의 소설을 돌연변이 주변성 등을 들 수 있습니다. 마지막으로,7 잔기 돌연변이를 갖는 변이체를 글리콜 알데히드 신타 제(GALS)로 명명했다. GALS 의 kcat 은 약 160 배 향상되었고 GALS 의 최종 촉매 효율은 9.6M−1·s−1 이며,이는 시작 효소보다 대략 70 배이다(도 1). 3a 및 보충도. 7).

하기 위해 그림 밖으로 돌연변이 어떻게 이러한 개선 효소 활동을 제안했습을 다시 실행하는 결정화의 여자들. 활성 포켓은 GALS38 의 homodimer 의 인터페이스에서 찾습니다., GALS 의 단백질 구조는 여러 차례의 돌연변이 후에 시작 단백질과 다를 수 있습니다. 여기에서 우리는 GALS 의 단백질을 결정화하고 bfd 의 구조를 검색 모델로 사용하여 GALS 의 결정 구조를 검색했습니다(보충 표 3). GALS 의 결정 구조를 분석 하였다(보충 그림 2). 8,보충 그림. 9). 우리가 발견의 돌연변이 L110E 소개 두 가지 추가 수소 결합하는 하이드록시 그룹의 중간 아날로그(IMA)에 기여할 수 있는 안정화 전환 상태 및 쪼개는 C–C 결합 사 제품과 공동 인자 ThDP(Fig. 3b)., L109G 의 돌연변이는 큰 이소 부틸 그룹을 수소 그룹으로 대체함으로써 기질 결합 포켓의 부피를 확대시켰다. A460m 의 세 번째 돌연변이는 기질을 재정렬 한 다음 ThDP 와 기질 사이의 상호 작용을 향상시킬 수 있습니다. 마지막 두 가지 돌연변이 H281V 및 Q282F 확장된 모공 radius 의 외부에 표면 수 있습에 대한 액세스를 용이하게하기 위해 기판 또는 제품(Fig. 3 기음). M1 과 비교하여,GAL 의 반응 포켓의 부피는 30%이상 확대되었으며,이는 촉매 활성의 개선의 주된 이유 일 것이다.,

acetyl-phosphate synthase

의 확인 자연에서 글리콜 알데히드로부터 AcP 의 합성을 달성하는 효소는보고되지 않았다. Phosphoketolases(PKs)는 fructose-6-phosphate(F6P)또는 xylulose-5-phosphate(x5p)39 에서 AcP 를 생산할 수 있습니다. PKs 의 촉매 메커니즘에 따르면,글리콜 알데히드가 ThDP 와 상호 작용 한 다음 2-α,β-디 히드 록시 에틸리 덴-ThDP(DHEThDP)를 생성 할 수있다(도 1). Pks 에 의해 F6P 또는 X5P 로부터 AcP 를 형성하는 핵심 중간체 인 4a). 우리의 가설을 확인하기 위해 8 명의 후보자를 선정했습니다(그림 1)., 도 4b)는 111 개의 박테리아 가족으로부터의 PKs 의 계통 발생 나무에 기초한다(보충 도 4b). 10). 유전자 합성 및 단백질 정제 후(보충 그림 2). 11),우리는 글리콜 알데히드를 기질로 사용하여 모든 후보 단백질의 촉매 활성을 조사했다. 다행히도,8 개의 Pk 중 5 개는 중요한 촉매 활성을 나타냈다. PK1,PK4 및 PK8 만이 블랭크 컨트롤과 유의 한 차이를 나타내지 않았다. 따라서,가장 높은 활성을 갖는 PK2 는 kcat/Km 가 3.21M-1·s−1 로 달성되는 아세틸−포스페이트 신타 제(ACPS)로 불린다(보충 도 1). 12).,

을 공개하는 메커니즘의 형성 DHEThDP 에서 glycolaldehyde,우리가 제안을 수행하는 이론에 근거한 분석 이전의 계산 모델 PK40. DHEThDP 의 형성과 관련된 모든 가능한 아미노산을 계산 모델을 구성하는 데 사용 하였다(보충 그림 2). 13)., 에 따라 전산 시뮬레이션,우리는 발견하는 에너지 장벽은 11.36kcal mol−1 의 형성을 위한 IM1(중급 1)glycolaldehyde 었 protonated 여 His553 되었으로 가장 가능한 양자 donor40(Fig. 4 기음). 그런 다음 IM1 은 Glu479 및 Glu437 의 도움을 받아 IM2 로 팽윤 화됩니다. IM2 는 에너지 적으로 IM1 보다 안정적입니다. IM2 의 양성자가 Thdp 에서 N4’에 의해 벗겨 졌을 때,IM2 에서 핵심 중간 DHEThDP 까지의 에너지 장벽은 15 입니다.,13kcal mol−1 은 f6p 를 substrate40 으로 사용하여 DHEThDP 를 형성하는 동안 변형 에너지와 유사합니다. DHEThDP 의 형성 후,다음의 촉매 공정은 다른 PKs 와 동일하다(보충 그림 2). 14),즉,H97 역할을 양성자를 기증자의 탈수 프로세스의 DHEThDP 및 His142 및 Gly155 을 가속화 탈수 프로세스의 DHEThDP,심사에서는 사실 His142 및 Gly155 형태로 수소 결합으로 물 분자 구조의 포스트-탈수 중급(AcThDP)., His64,Tyr501 및 Asn549 는 Pi 에 의한 친 핵성 공격에 중요하며 함께 Pi39 의 결합 부위를 형성합니다. 부위 지시 돌연변이 유발 실험은 또한 이들 잔기가 효소 활성에 중추적임을 나타냈다(보충 도 2). 15).

의 합성 acetyl-CoA 에서 포름알데히드에서 체외

으로 초기의 성공적인 디자인의 여자들과 ACP 리하도록 구성 SACA 경로에 체외 합성 acetyl-CoA 에서 포름알데히드도 있습니다. 첫째,우리는 포름 알데히드의 다른 농도에서 GALS 에 의한 글리콜 알데히드의 수율을 측정했습니다., 이 결과는 여자들을 효과적으로 수 촉매 dimerization 의 포름알데히드,그리고 수확량 glycolaldehyde 증가 농도로 기판 향상(그림. 5a). 예를 들어,포름 알데히드로부터의 글리콜 알데히드의 수율은 0.5g L−1 에서 45%에서 2g L−1 에서 80%로 증가했다. 둘째,우리는 검사 촉매에서 효율 glycolaldehyde 을 AcP 는 계량의 내용에 의해 아세트산 이후 AcP 것 빨리 성능 저하로 아세트산(부가 Fig. 16)23., 결과는 AcP 의 수율이 ACPS 를 통해 글리콜 알데히드의 상이한 농도 하에서 80%이상에 도달 함을 보여 주었다(보충 도 2). 17). 불행하게도,acps 는 포름 알데히드에 의해 명백하게 억제되었다(도 1). 5b). 따라서,이 충돌을 해결하기위한 포름 알데히드의 농도에 대한 균형을 취할 필요가있다.

을 최적화하기 위해 농도의 포름알데히드,그라데이션을 실험을 이용하여 수행된 반응 시스템이 포함된 2mg mL−1 뷰 및 ACP. 으로 농도가 증가의 포름알데히드,수율의 아세트산 시스템에서 처음 증가 및 감소(Fig. 5 기음). 포름 알데히드의 농도가 1g L-1 일 때,아세트산의 수율은 50.6%에 도달 하였다., 흥미롭게도,최종 수익률의 아세트산보다 더 높은 것입니다 그에 반응 시스템에서 glycolaldehyde 을 AcP 으로 같은 양의 포름알데히드(그림. 5b,회색 선). 이것은 포름 알데히드가 GALS 에 의해 점차적으로 소비 되었기 때문에 acps 의 기능을 부분적으로 방출함으로써 야기 될 것입니다. 이 시스템에 기초하여,우리는 AcP 를 아세틸-CoA 로 전환시킬 또 다른 알려진 효소 포스페이트 아세틸 트랜스퍼 라제(PTA)를 더 추가했다. 마지막으로,SACA 경로는 1g L−1 의 포름 알데히드 농도에서 5.5mM 아세틸-CoA 를 생성 하였다. 포름 알데히드로부터의 아세틸-CoA 의 수율은 약 33%였다(도 1). 5d)., 그러나 포름 알데히드(33.3mM)로부터의 아세트산(7.8mM)의 수율은 PTA 및 CoA 가 공급되지 않으면 50%에 도달했다. 아세트산의 그것 보다는 아세틸 CoA 의 더 낮은 수확량은 아세틸 CoA 와 AcP 의 불안정성에 기인할 것입니다. 우리의 결과는 체외에서 SACA 경로에 의해 포름 알데히드로부터 아세틸-CoA 의 생합성에 성공적임을 나타냈다.,

의 검증 SACA 통로 13C-라벨

를 확인 후 SACA 통로로 정제 효소 외에서,우리는 더려 테스트의 생합성 acetyl-CoA 및 그것의 유도체에서 SACA pathway in vivo13C-대사 추적 분석 실험(Fig. 6a). 첫째,13c 표지 된 포름 알데히드 및 CoA 를 첨가하여 아세틸-CoA 의 생합성을 검증하기 위해 세포 용해물을 사용 하였다. 우리는 다른 대조군(P-value<0.001,T-test)보다 이중 13C 표지 된 아세틸-CoA 의 유의 한 증가를 검출했다(그림 1). 6b 및 보충도. 18)., 또한,우리가 ACPS 및 PTA 와 같은 saca 경로에서 유전자 중 하나를 생략하면 이중 13C 표지 된 아세틸-CoA 의 증가는 사라졌다(보충 그림 2). 19). 또한,아세틸-CoA 는 옥살로 아세테이트와 수렴되어 트리 카르 복실 산(TCA)사이클에 들어갈 것이다. 우리는 또한 감 훨씬 더블 13C-labeled 푸마르산(P-value<0.001,T-테스트)및 말라테(P-value<0.001,T-테스트)만 스트레인에서 SACA 경로 및 13C-labeled 먹이 포름알데히드(그림. 6b 및 보충도. 18)., 그러나,우리는 고차 질량 이소 토포 머(high order mass isotopomers)에서 유의 한 차이를 검출하지 못했다. 그것은 tca 사이클에서 이중 13C-표지 된 이소 토포 머의 낮은 양에 의해 야기 될 것이다.

이후,우리는 우리 제안을 테스트하는 탄소 내의 유동 세포입니다. 때문에 독성의 포름알데히드를 세포로 우리가 소개된 메탄올 dehydrogenase 에서 균 stearothermophilus(BsMDH)41 을 유지하는 지속적으로 낮은 농도의 포름알데히드 vivo 에서(그림. 6a). 배양된 세포는 수확이 다른 시간에 포인트 사용되었을 감지하 을 아미노산과 세포 대사물(그림. 6 기음)., 우리는 SACA 경로(BsMDH-SACA)가있는 균주가 tca 사이클에서 유래 한 이중 13C 표지 된 아스파 테이트와 글루타메이트를 더 많이 함유하고 있음을 발견했다. 또한,13C-labeled 포도당과 phosphoenolpyruvate 수 있는 생성에서 더블 13C-labeled 어냅를 통해 당 생합성 경로 검출되었다 더 부담 BsMDH-SACA 에서 그들 보다는 컨트롤 변형(BsMDH-28a). 따라서 우리의 결과는 saca 경로가 포름 알데히드로부터 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA 유래 대사 산물을 생산하는 데 기능적이라는 것을 나타냈다.,

의 평가 SACA 통해서 세포의 성장을

하기 위해서 추가 평가하 SACA 통로 생체 내에서,우리가 제안을 테스트하는 세포의 성장 단계적으로 공급하여 각 중간에서의 통로입니다. 초기에 대장균은 풍부한 배지 아래에서 자란 다음 글리콜 알데히드를 보충 탄소원으로 첨가 하였다. 글리콜 알데히드의 상이한 농도를 첨가함으로써(보충도 2). 20),우리는 saca 경로를 포함하는 공학 균주가 0 이상인 것을 발견했다.,4g L−1 글리콜 알데히드 공급은 글리콜 알데히드 또는 SACA 경로가없는 균주보다 현저한 높은 OD600 을 갖는다(도 1). 도 7a 및 보충도. 21). 바이오 매스(세포 건조 중량,CDW)에 대한 글리콜 알데히드의 기여는 0.681±0.028gCDWg−1(n=3)글리콜 알데히드였다.

때 우리가 테스트를 사용하여 세포의 성장 포름알데히드는 보충적인 탄소원,성장의 변형 빈 벡터 완전히 억제하여 80mg L1 의 포름알데히드(그림. 7b). 변형이 포함된 SACA 통로 처음에 저해하고 그 성에서 정상적으로 동일한 조건으로 인해 발생할 수 있습니다 그리 빠른 속도의 소비량 포름알데히드보다 스트레인 빈 벡터(보충 Fig. 22)., 불행하게도 SACA 경로를 포함하는 균주는 포름 알데히드가없는 것보다 포름 알데히드의 보충으로 더 많은 바이오 매스를 갖지 않았다. 이러한 결과 표시지만 SACA 통로는 더 효율적인 제거를 위한 독성 포름알데히드,그것으로는 충분하지 않을 제공하는 바이오매스.

마지막으로,우리는 포름 알데히드로 연속적으로 전환 될 메탄올을 공급함으로써 SACA 경로를 평가하고자했다. 우리가 발견되는 변형이 모두 포함하는 BsMDH 및 SACA 통로는 더 높은 OD600 보다 그들이트 메탄올 공급 또는 SACA 경로(그림. 7c 및 보충도., 23). 후 26 서 인큐베이션,우리가 발견한 것의 가치 OD600 에 변형이 모두 포함하는 BsMDH 및 SACA 통로 증가에 대해 0.2 는 크게 높이는 보다는 부담없이 SACA 경로(P-value=0.005,T-테스트). 과 비교하여 부담없이 SACA 통로,우리는 발견하는 금액의 바이오매스에서 파생된 메탄올 0.03±0.006gCDW g−1(n=3)메탄올에서 변형을 포함하는 SACA 의 통로입니다.피>