次世代シーケンシング（NGS）法は、2000年代半ばに文献に登場し始め、微生物ゲノミクスおよび感染症の理解に変革の効果をもたらしました。 がしかしな論争において、どのように人々が、次世代シーケンスの役割を担っており、臨床診断薬の研究所です。, Journal of Clinical Microbiologyからのdeep dive point-counterpoint discussionは、メタゲノム次世代シーケンシング（mNGS）を日常的な研究室に導入することに伴う課題と機会について議論しています。 MNGSは正確には何であり、それはそこに他の多くの核酸技術とどのように違うのですか？

メタゲノム次世代シーケンシングとは何ですか？

次世代シーケンシングは、数十億の核酸断片を同時かつ独立して配列することができるいくつかの高スループットシーケンシング方法のいずれか, この技術は、反応ごとに一つのヌクレオチド配列を処理するサンガーシーケンシング（ジデオキシヌクレオチド鎖終結シーケンシングとしても知られている）
例えば、ngsを用いて細菌ゲノムを特徴付けるために、ゲノムを複数の断片に分割して配列を生成したり、長さが数百から数万塩基の範囲を読み取ったりする。 配列は計算アプローチを用いて単一のゲノムに組み立てられる。 複数の重複する配列を読み込みをつなぎ合わせたものを単な配列と呼ばれるコンティグ., コンティグ間にはしばしばギャップがあり、忠実度の高い長いシーケンス読み取りがシーケンスの理想的な方法ですが、短い読み取りを生成するプラットフォーム 構築されたゲノム（ギャップを含む可能性が高い）は、生物の同定のための参照データベースに整列される。 この技術を用いることにより、一充実事前の初期の列が単一の細菌ゲノムプロジェクトが数年です。,
Metagenomic NGS（mNGS）は、単に微生物の混合集団を含むことができる試料中のすべての核酸を実行し、それらの参照ゲノムにこれらを割り当てて、どの微生物が存在 メタゲノム解析のために複数の異なる分類群から核酸を配列し、同定する能力は、これを同時に生物の全く異なる王国から遺伝物質を同定することができる強力な新しいプラットフォームになります。,
感染症の診断、アウトブレイクトラッキング、感染制御サーベイランス、突然変異や病原体の発見など、臨床応用の可能性は非常に大きい。 臨床試料のｍｎｇは、脳脊髄液、血液、呼吸器試料、胃腸液、眼液などの様々な種類の試料に適用されてきた。

メタゲノム次世代シーケンシングの利点は何ですか？,

mngの最大の強みは、増幅され検出される特定の標的の同定のためにプライマーに依存する標的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法とは異なり、それが公平な仮 普遍的または広範囲のPCR法でさえ、保存された16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子および内部転写スペーサー（ITS）配列の特定のプライマーを使用して、バイオインフォマティックに細菌/古細菌または真菌にそれぞれ分類することができる独特の核酸配列を増幅するため、メタゲノムと見なされるほど十分に広いものではない。,
ユニバーサルプライマーは、分子検査で多発性微細菌感染症を診断する際にも問題を引き起こす。 16Sシーケンシングを使用するときにpolymicrobial集団が存在する場合、ヌクレオチドごとに複数の塩基呼び出しが行われ、解釈できない混合ヌクレオチドクロマトグラムを生成する。 同定された生物を予測するために利用可能な脱たたたみ込み計算方法がありますが、これらは多くの研究室で標準的に使用されておらず、多くの場合、ポリマイクロビアルサンプルの16s遺伝子の次世代シーケンシングに反映されています。,

メタゲノム次世代シーケンシングの課題は何ですか？

mNGSの可能性にもかかわらず、技術が主流の研究室の一部になる前にクリアするための多くの障壁と、その診断ユーティリティについての理解のギャップがあります。 主な予約には、調査結果の解釈（汚染とコロニー形成を真の病原体と区別する）、分析に使用されるデータベースの選択と検証、および抗菌感受性の予測（または, 一般的な認識は、mNGSが非常に敏感であるため、他のすべての検査が陰性であるときに診断が明らかになるということです。 Mngは標準的な培養方法よりも解析的に感度が高い場合がありますが、配列調製中および解析後のプロセス中に（計算方法による）膨大な量のヒト核酸除去が必要であるため、多くの生物にとって標的PCRアプローチと比較して感度が低下する可能性があります。
mNGSの特異性は、部屋の中でことわざの象のままです。, 標本採取中のサンプルの汚染は、標準的な培養法と比較してmNGSの分析感度が高まることを考えると大きな懸念であり、試薬の純度を評価してから適切なゲノムカバレッジコントロールを測定するまでのステップについては、検証済みの品質管理プロセスが必要です。 また、一部のIlluminaプラットフォームでは、間違ったバーコードの指標を指定することができ、誤検知に配列データです。, バイオインフォマティック品質管理は、高品質で検証済みのゲノムが最小限のデータベースエラーで利用可能であることを保証するために必要であり、理想的には、各テストの配列決定の結果を解釈するために利用可能なバイオインフォマティックスタッフがいるであろう。, 連邦医薬品局（FDA）は、FDA-ARGOS（FDA-database for regulatory-grade microbial sequences）というタイトルのデータベースをキュレーションするために他の連邦機関と協力していますが、これは現在のmng結果が信頼でき、正確であることを保証するために有用でしたが、これらのリソースを更新して維持する必要があります。
mngの臨床的特異性を取り巻く大きな疑問は残っている：患者の現在の病気に寄与している病原体から検出された配列はありますか？, MNGS試験の分析的特異性は、標本コレクション、シーケンシングライブラリの準備、アッセイ実行、およびバイオインフォマティック分類を通じて厳格なコントロールで対処することができますが、臨床的特異性 臨床的有用性および適用性を決定するのに役立つ質問は次のとおりです。血液/血漿mng試験において、一過性の菌血症に関連する生物を経口/胃腸細菌叢または皮膚コロニーからどのように区別できますか。, どう解の深さを報告し、どのように信頼る場合がありますので、ご使用をシーケンスの深さをtrueに感染? この関係は病原体/宿主によって異なりますか？ 患者が適切な治癒療法を受けてから、mNGSによって病原体の予想される検出可能な半減期はどのくらいですか？ 研究および発見の観点からのこの技術の明白な力にもかかわらず臨床有用性および費用効果の調査は非常に必要である。,
また、現在、微生物検査のために送ることができるFDAクリアまたは承認されたmNGS試験はないことを指摘する価値がありますが、1988年の臨床検査改善改正（CLIA’88）の下で認定された臨床試料に関する試験を提供している研究所があります。 今日まで、例えば嚢胞性線維症の腫瘍学的検査または検出のために、FDAによって少数の診断NGSシステムのみがクリアされている。, 最近のレビューでは、mngがFDA検証済みの試験として主流の臨床診断研究所に入る前に対処する必要がある規制上のハードルと考慮事項の多くについて詳しく説明しています。
要約すると、mNGS検査は、将来的には微生物学的診断ワークフローにおいて大きな役割を果たす可能性がありますが、特にシーケンシングとバイオインフォマティクス処理能力が進化するにつれて、これは複雑な技術であり、現在の医療現場の環境における臨床的ユーティリティは不明なままです。, MNGS検査は、近い将来に新規で刺激的な診断臨床機会を提供するかもしれませんが、それのどれもがすぐに抜け目のない臨床医に取って代わるでしょう。