DNA修復経路とヒトがん素因との間の遺伝的関係は、DNA損傷特定の部位を認識し修復するタンパク質への関心を高めてきた。 修復酵素は、細菌から真菌、ヒトまで著しく保存されており、変異原性の負担に直面してゲノムの完全性を維持することに置かれるプレミアムを強調, DNAは、複製中に生じる誤りや、放射線、酸化剤、またはアルキル化剤などの環境要因によって引き起こされる損傷の影響を受けやすい。 修復反応には、DNA二重鎖から化学的に変化した塩基または不対塩基の切除が含まれる。 結果として生じる隙間はDNAポリメラーゼによって埋められ、この反応は修復部位にニックを残すか、または隣接する。 染色体DNA複製中に同様のプロセスが起こり、岡崎断片の不連続合成を主なものとする5′-RNAセグメントが切除され、その隙間がDNAポリメラーゼによって埋められる。,

DNA修復および複製経路は、修復されたDNA鎖の連続性が、ニックをホスホジエステル結合に変換する酵素であるDNAリガーゼによって復元される共通 ニックは潜在的に有害なDNA病変であり、修正されなければ致命的な二本鎖切断を引き起こす可能性があります。 したがって、DNAリガーゼ機能の全損失は致命的である。

DNAリガーゼ反応

DNAリガーゼは、5′-リン酸末端鎖の3′-ヒドロキシル末端鎖への結合を触媒する。, ライゲーションは、マグネシウムと高エネルギー補因子、ATPまたはNAD+のいずれかに依存する。 この反応機構は3つの連続ヌクレオチジル転移反応を伴う。 最初のステップでは、リガーゼによるATP（アデノシン三リン酸）またはNAD+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）のα-リンに対する求核攻撃により、ピロリン酸またはNMN（ニコチンアミドモノヌクレオチド）が放出され、AMPがリジンのイプシロンアミノ基にホスホアミド（P-N）結合を介してリンクされる共有結合中間体（リガーゼ-アデニル酸）が形成される。, 第二段階では、AMPを5′-リン酸末端DNA鎖の5’末端に移し、dna-アデニル酸-逆ピロリン酸橋構造AppNを形成する。 この反応では、DNA鎖の5′-リン酸酸素がリガーゼ-アデニル酸のリンを攻撃し、活性部位のリジン側鎖が脱離基である。 第三段階では、リガーゼはDNA-アデニル酸上のニックの3′-OHによる攻撃を触媒して2つのポリヌクレオチドに結合し、AMPを遊離する。

系統発生分布

生きている生物は、真正細菌、始祖細菌、真核生物の3つのドメインからなる。, すべての生物は1つ以上のDNAリガーゼをコードする。 リガーゼは、リガーゼ-アデニル酸の形成に必要なヌクレオチド基質に従って、ATP依存性リガーゼとNAD+依存性リガーゼの2つのファミリーに分類される。 ATP依存性DNAリガーゼは3つのドメインすべてに存在する。 NAD+依存性DNAリガーゼ（LigA）は、それらが成長のために不可欠であり、抗感染性創薬のための魅力的なターゲットを提示する細菌に遍在しています。 NAD+依存性リガーゼは、例えば、生命の細菌ドメインの外に散発的にのみ遭遇する,、好塩性古細菌および特定のDNAウイルスにおいて、おそらく水平遺伝子導入によってこれらの分類群に獲得された。

真核細胞ATP依存性リガーゼ

ATP依存性DNAリガーゼは、すべての真核生物の種に見出される。 哺乳類細胞には四つのDNAリガーゼアイソザイムが含まれている。 アミノ酸配列比較は，すべてのＡＴＰ依存性リガーゼに共通するコア触媒ドメインが蛋白質のアミノまたはカルボキシル末端に位置する追加のアイソザイム特異的ドメインによって装飾されることを示唆した。, これらの隣接セグメントは、DNA複製、修復、および組換えに関与する他のタンパク質への哺乳動物DNAリガーゼの結合を媒介すると考えられている。 DnaリガーゼIは、すべての組織で発現される919-アミノ酸ポリペプチドであり、DNA複製中の岡崎断片の結合を触媒し、DNA修復にも役割を果たす。, DNAリガーゼIIIa（922アミノ酸）とIIIb（862アミノ酸）は、単一の遺伝子の産物であり、代替mRNAスプライシングの結果として、カルボキシル末端でのみアミノ酸配列が異なる。 リガーゼIIIaは遍在的に発現し、DNA修復に関与し、ミトコンドリア機能のために不可欠である。 リガーゼIIIbの発現は、減数分裂を受けて精母細胞に特異的に、精巣に制限されています。 DNAリガーゼIVは、非相同末端結合（NHEJ）を介して二本鎖DNA切断の修復に役割を果たす911アミノ酸ポリペプチドである。,

酵母細胞には、それぞれ哺乳類のDNAリガーゼIおよびIVと相同な2つの別々にコードされたDNAリガーゼが含まれています。 出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのDNAリガーゼI（Cdc9p）は、細胞増殖に不可欠である。 遺伝子実験では、岡崎断片のシールとDNA切除修復の完了にリガーゼIが関与しています。 対照的に、酵母ＤＮＡリガーゼＩＶは、細胞増殖に必須ではない。 しかし、LIG4遺伝子の欠失は、リガーゼIVが非相同末端接合経路（NHEJ）における二本鎖切断の修復を触媒することを示す表現型を引き出す。, 出芽酵母は、哺乳類DNAリガーゼIIIの明らかな相同体を持っていません。

ウイルスATP依存性DNAリガーゼ

大腸菌バクテリオファージT4、T6、T7、およびT3などの細菌DNAウイルスは、独自のATP依存性DNAリガーゼをコードします。 ATP依存性DNAリガーゼはまた、細胞質においてそれらの複製サイクルの一部または全部を行う真核生物DNAウイルスによってコードされる。 これらには、ワクシニアウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、クロレラウイルスPBCV1が含まれます。 バクテリオファージおよび真核生物ウイルスDNAリガーゼは、それらの細胞の対応物よりも小さい。, 552アミノ酸ポリペプチドであるワクシニアDNAリガーゼは、哺乳類のDNAリガーゼIIIとアミノ酸配列レベルで著しく類似しており、実際、リガーゼIIIは哺乳類のリガーゼIおよびIVよりもワクシニアリガーゼと密接に関連しており、T4(487アミノ酸)、T7(359アミノ酸)、T3(346アミノ酸)、クロレラウイルス(298アミノ酸)のリガーゼは依然として小さい。 我々は、クロレラウイルスリガーゼは、DNAリガーゼI遺伝子が削除された酵母株の成長を補完することができることを示してきました。, この結果は，はるかに大きなＤＮＡリガーゼｉに特有の蛋白質セグメントが酵母細胞増殖に必須ではないことを示唆している。

DNAリガーゼによるニックセンシング

我々は、モデルとしてウイルスコードされた酵素を使用してDNAと真核生物リガーゼの相互作用を調べました。 ワクシニアウイルスＤＮＡリガーゼおよびクロレラウイルスＤＮＡリガーゼはそれぞれマグネシウムの非存在下で単独でニック状ＤＮＡリガンドと離散複合体を形成し，遊離ＤＮＡからネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解できる。, ウイルスリガーゼは、(i)1-ヌクレオチドまたは2-ヌクレオチドギャップを含むDNA、(ii)ライゲーション反応の密封された二重鎖DNA産物、(iii)5′-リン酸の代わりにニックに5′-OH末端を含む単一ニック二重鎖、または(iv)ニックの5′-リン酸側にRNA鎖を含む単一ニック二重鎖（10-15）と安定な複合体を形成しない。 したがって、ウイルスATP依存性DNAリガーゼは、固有のニックセンシング機能を有する。,

ワクシニアDNAリガーゼおよびクロレラウイルスDNAリガーゼによるニック認識は、酵素に対するAMP結合ポケットの占有にも依存する—すなわち、リガーゼ-アデニル酸中間体を形成する能力を廃止するリガーゼ活性部位の変異もニック認識を排除する。, DNA結合リガーゼによるヘリカルヌクレオチドの隔離は、他のDNA修飾および修復酵素によって使用される標的部位認識および触媒作用の”塩基反転”メカニズムを彷彿とさせる。

5′-リン酸部分は、クロレラウイルスリガーゼのニック化DNAへの結合に不可欠であるが、3′-OH部分はニック認識に必要ではない。 クロレラウイルスリガーゼは、2’、3’ジデオキシおよび5′-リン酸テルミニを含むニッケドリガンドに結合するが、5’末端のアデニル化を触媒することはできない。, したがって、3′-OHは、DNA-アデニル酸形成の間にそれ自体が化学的に変換されないにもかかわらず、ステップ2の化学にとって重要である。

リガーゼ-DNA界面を描くために、我々はDNA上のリガーゼ結合部位をフットプリントした。 二重DNAの単一のニックに結合したリガーゼのエキソヌクレアーゼIIIフットプリントのサイズは19-21ヌクレオチドである。 フットプリントは非対称であり、ニックの8-9ヌクレオチドは3′-OH側に、11-12ヌクレオチドは5′-リン酸側に伸びている。,

真核生物DNAリガーゼ-アデニル酸の結晶構造

クロレラウイルスDNAリガーゼ（ChVLig）は、知られている最小の真核生物ATP依存性リガーゼです。 “最小”ＤＮＡリガーゼとして、それは構造決定のための魅力的な標的を提示した。 ChVLigを結晶化させ、2Åの分解能でその構造を決定した。 この酵素は，より大きなＮ末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｎｔａｓｅ）ドメインと，それらの間に裂け目を有するより小さなＣ末端ＯＢドメインからなる。 AMP部分は、活性部位でLys27のNzに共有結合していた。, したがって、我々は本物の触媒中間体の構造を有する。

NTaseドメイン内には、DNAおよびRNAリガーゼおよびmRNAキャッピング酵素を含む共有結合ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素スーパーファミリーを定義する六つのペプチドモチーフ（I、Ia、III、IIIa、IV、およびV）からなるアデニル酸結合ポケットがある。 モチーフI（KxDGxR）は、AMPがリガーゼ反応の最初のステップで共有結合になるリジンを含んでいます。 モチーフIa、III、IIIa、IV、およびVのアミノ酸はAMPに接触し、結紮経路の一つまたは複数のステップにおいて必須の役割を果たす。, ＯＢドメインは五本鎖反平行ベータバレルとアルファヘリックスからなる。

最小限の”多能性”DNAリガーゼによるニック認識のための構造的基盤

ChVLigは真核細胞DNAリガーゼに見られる大きなN末端隣接ドメインを欠いているが、それは細胞内のリガーゼの唯一のソースであるとき、それは有糸分裂増殖、DNA修復、および出芽酵母に結合する非同種末端を維持することができる。 ChVLigは、ミトコンドリアDNA代謝において哺乳類Lig3の本質的な機能を果たすことさえできる。, 我々は、ChVLigは、その固有のニックセンシング機能のためにストリップダウン”多能性”リガーゼを表していることを提案し、その基礎は、我々は2.3ÅのChVLig-AMPの結晶構造を3′-OH/5′-PO4ニック二重DNAにバインドされたときに点灯した。

ChVLigはDNAをC型タンパク質クランプとして取り囲んでいる。 NTaseドメインは、ニックに隣接する主溝およびニックの3′-OH側の副溝において、壊れた無傷のDNA鎖に結合する。 OBドメインは、ニックの後ろの二重の表面のマイナー溝を横切って結合する。, ＯＢドメインから発せられるベータヘアピンループからなる新しい”ラッチ”モジュールは，主要な溝を占め，ループの先端とＮｔａｓｅドメインの表面との間の接触を介して円周クランプを完了する。 掛け金はクランプ閉鎖のために重大、ニックの感知の主決定要因である。

自由およびnick結合ChVLig-AMPの結晶構造の比較は、nick認識に伴う大きなドメイン再配列を明らかにする。, 遊離Ｃｈｖｌｉｇ-ＡＭＰにおいて、ＯＢドメインはＮｔａｓｅドメインから反射され、ＡＭＰ結合ポケットの上のＤＮＡ結合表面を完全に露出する。 ラッチになる運命にあるペプチドセグメントは、遊離リガーゼで無秩序であり、タンパク質分解に敏感である。 しかし、ChVLigがニックdnaに結合すると、このセグメントはタンパク質分解から保護されます。 DNA結合は、スイベルの周りのOBドメインのほぼ180回転を伴い、OBベータバレルの凹面表面がDNAマイナー溝に収まるようにする。, この遷移は、OBドメインの63Åの動きを引き出し、DNA主要溝の深いラッチを配置します。

活性部位における3′-OHおよび5′-PO4テルミニとの相互作用のネットワークは、DNAアデニル化機構およびニックセンシングおよび触媒作用におけるAMP 二価カチオンの添加は、それによってニック複合体がDNA修復経路における善意の中間体であることを確立し、結晶中のニックシールを引き起こした。,

NICKED DNA-adenylateに結合したNAD+依存性DNAリガーゼの構造

NAD+依存性DNAリガーゼ（LigAと呼ばれる）は、すべての細菌に見られる酵素の独特で構造的に均質なクレードである。 E.coli LigA(671-aa)はこのファミリーのプロトタイプです。 LigAはNTaseドメインとOBドメインからなる中央ligaseコアを中心に構築されたモジュラーアーキテクチャを持っている。 コアはＮ末端”Ｉａ”ドメインと三つのＣ末端モジュールに隣接している：テトラシステインジンクフィンガー，ヘリックスヘアピンヘリックス（Ｈｈｈ）ドメイン，およびＢＲＣＴドメイン。, 連結経路の各段階は、LigAドメインの異なるサブセットに依存し、すべての段階に必要とされるのはNTaseドメインのみである。 ドメインIaは、NAD+依存性リガーゼに固有であり、NAD+のNMN部分を結合する責任があり、NAD+との反応がリガーゼ-AMP中間体を形成するために必要である。

我々は、NAD+依存性大腸菌DNAリガーゼは、CDC9のために単独またはcdc9プラスLIG4のために二重に削除されたSaccharomyces cerevisiae株の成長をサポートすることができること, これは、NAD+依存性酵素が真核生物において生物学的に活性であることを初めて実証したものである。 その後の研究（Maria Jasinと共同で）は、大腸菌LigAが必須Lig3酵素を欠いているマウスES細胞におけるリガーゼ機能に十分であることを示した。

ニック状DNA-アデニル酸中間体に結合した大腸菌LigAの結晶構造は、LigAもC字型タンパク質クランプとしてDNAヘリックスを取り囲んでいることを明らかにした。 タンパク質-DNAインターフェイスは、ニックを中心とした二重DNAの19bpセグメント上のNTase、OB、およびHhHドメインによる広範なDNA接触を伴う。, NTaseドメインは、壊れたDNA鎖に結合し、ニックに隣接し、OBドメインは、ニックを囲む連続テンプレート鎖に接触し、HhHドメインは、フットプリントの周囲にマイナー溝を横切って両方のストランドをバインドします。 ＺｎフィンガーモジュールはＯＢドメインとＨｈｈドメインの橋渡しに構造的な役割を果たした。 ドメインＩａは、Ｄｎａ二重鎖への接触を行わず、Ａｐｐｄｎａ基質上の鎖閉鎖の触媒作用のためのその不注意性と一致する。,

LigA NTaseおよびOBドメインは、ATP依存性DNAリガーゼのNTaseおよびOBドメインと同様にDNA周囲に配置され、DNA鎖の同様のセグメントを”フットプリント”する。 しかし、LigAクランプのトポロジーは、ChVLigおよびヒトDNAリガーゼ1によって形成されたクランプ（Hulig1、Tom Ellenbergerらによって決定）とは全く異なっている。 LigAクランプを閉じる接吻接点は、NTaseドメインとC末端HhHドメインを含むsui generisである。, 利用可能な構造データに基づいて、DNAリガーゼはDNAを取り囲む少なくとも三つの異なる手段を進化させたことは明らかである。

大腸菌LigA—AppDNA複合体と、バイナリLigA•—NAD+複合体（ステップ1基質）、バイナリLigA•—NMN複合体（ポストステップ1脱離基）、および共有結合リガーゼAMP中間体（脱離基解離後のstep1産物）としてキャプチャされた他の細菌リガーゼの構造との比較は、基質結合および触媒作用と同期して起こる大規模なタンパク質ドメイン再配列（50-90Åのオーダー）を強調する。, LigAによるDNA結合とクランプ形成は、OBドメインのほぼ180回転を伴い、OBベータバレルの凹面表面がchvligおよびHuLig1で見られるか推測されるものと同様に、小溝に収まる。 LigA-DNAフットプリントの周辺におけるHhHドメインの四点結合は、ニックを中心とするDNAベンドを安定化させる。 すぐにニックに隣接するLigA-DNA相互作用は、再びHuLig1-DNAコクリスタルの知見をエコー、RNAのようなa形ヘリックスの採用で、その結果、局所DNA歪みを誘発する。,

ATP依存性およびNAD+依存性ポリヌクレオチドリガーゼによるリジンアデニル化のメカニズム

ポリヌクレオチドリガーゼの自動アデニル化反応は、ATP依存性DNAおよびRNAリガーゼおよびNAD+依存性DNAリガーゼに保存されているヌクレオチドトランスフェラーゼ（NTase）ドメインによって行われる。 NTaseドメイ モチーフｉ（Ｋｘｄｇ）はＡＭＰに共有結合するようになるリジンを含む。 ロバート-リーマンが1974年に指摘したように、どのようにリジン（予測されたpKa値が-10であるかは不明である。,5)atpまたはNAD+のαのリンの攻撃に必要な無陽子状態を達成するために生理学的なpHでプロトンを失います。 原則として、リガーゼはリジンを脱プロトン化するために一般的な塩基を用いることができる。 あるいは、ｐｋａは、リジン-Ｎｚを取り囲むタンパク質アミノ酸の正電荷電位によって下げることができる。 金属を含まないリガーゼのいくつかの結晶構造は、どちらの説明にも不十分な支持を提供した。 これらの構造において、モチーフIリジン求核剤は、モチーフIVグルタミン酸またはアスパラギン酸側鎖の隣に位置する。, リジンとモチーフＩＶカルボン酸塩はイオン対を形成し，その期待される効果は周囲の負電荷によってリジンのｐｋａを増加させることである。 グルタミン酸またはアスパラギン酸アニオンがリジンカチオンからプロトンを抽象化するための一般的な塩基として役立つ可能性は低い。 この問題に対する潜在的な解決策は、二価の陽イオンがリジン-Nzに接し、そのpKaを押し下げる場合である。,

金属駆動機構は、ATPとマンガン（その好ましい金属補因子）とのステップ1ミカエリス複合体としてNaegleria gruberi RNAリガーゼ（NgrRnl）の最近の結晶構造によって明らかに Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ様複合体を捕捉する鍵は，イソステリックメチオニンによるリジン求核剤の置換であった。 1.9Åの構造は活性部位にATPと二つのマンガンイオンを含んでいた。 “触媒的”金属は八面体構造で五つの水に配位し，それはモチーフｉ，ＩＩＩおよびＩＶの保存残基のカルボキシレート側鎖によって配位した。, 触媒金属錯体中の第六配位子部位はＡＴＰ αりん酸酸素によって占められ，自動アデニル化反応の遷移状態を安定化する金属の役割を示した。 共有結合Ｎｇｒｒｎｌ-（Ｌｙｓ-Ｎｚ）–ＡＭＰ中間体の構造上のＭｉｃｈａｅｌｉｓ錯体の重ね合わせによって強化された重要な洞察は，触媒前のリジン求核剤の非プロトン化状態の安定化における触媒金属錯体の役割を懸念した。, Ｎｇｒｒｎｌｍｉｃｈａｅｌｉｓ錯体は四つの水およびＡＴＰΒおよびγりん酸酸素に八面体に配位する第二の金属を示した。 金属錯体とＡＴＰΒりん酸は，Ｐｐｉ脱離基頂端をリジン求核剤に集合的に配向させるアミノ酸側鎖のアンサンブル（Ｎｇｒｒｎｌに特有）によって関与していた。 シングルステップインライン機構と一致して，αりん酸はＮｇｒｒｎｌ-ＡＴＰミカエリス複合体からリシル-ＡＭＰ中間体への遷移中に立体化学的に反転した。,

DNAリガーゼはRNAリガーゼとは別に進化したと考えられており、最初は祖先のATP利用NTaseドメインをC末端OBドメイン（DNAリガーゼの最小限の触媒コアを構成する）に融合させ、続いてNTase-OBコア（7）に追加の構造モジュールを融合させることによって進化したと考えられている。 細菌に遍在し、細菌の生存率に不可欠であるNAD+依存性DNAリガーゼ（LigA酵素）は、NTaseドメインのN末端にNMN結合Iaドメインモジュールの融合を介してNAD+のため, 大腸菌DNAリガーゼ（EcoLigA）は、発見され、特徴付けられた最初の細胞DNAリガーゼであり、NAD+依存性DNAリガーゼファミリーの構造および機能研究のための最高のモデル LigAメカニズムへの関心は、抗細菌創薬のためのLigA（その署名NAD+基質特異性とユニークな構造的特徴vis à visヒトDNAリガーゼを介して）を標的とする約束によって推進されている。

我々は、NAD+とマグネシウムとミカエリス錯体としてEcoLigAの1.55Åの結晶構造を解決しました。, この構造は、リガーゼ結合Mg2+(H2O)5複合体がリジンpKaを低下させ、NAD+αリン酸と係合する一金属メカニズムを明らかにするが、Βリン酸とNMN脱離基のニコチンアミドヌクレオシドは、リガクレードに固有のタンパク質要素との原子相互作用を介してのみ配向している。 二金属（ATP依存性リガーゼのための）対一金属（NAD+依存性リガーゼのための）二分法は、リガーゼの進化における分岐点を画定します。