合成アセチルCoA経路の設計
一炭素から有機炭素を合成する最も簡単な方法は、それを一つずつ構築することである。, 一つの炭素から人工アセチルCoA経路を構築するために，二つのホルムアルデヒド分子を三つのステップで一つのアセチルCoA分子に移動させる合成アセチルCoA（SACA）経路を提案した。 1a）。 まず、ホルムアルデヒドはグリコールアルデヒドシンターゼ（GALS）によってグリコールアルデヒド（GALD）に凝縮される。 そしてグリコールアルデヒドは無機リン酸塩を用いたアセチルリン酸合成酵素（ＡＣＰＳ）によってアセチルリン酸（Ａｃｐ）に変換される。 最後に、AcPは既知の酵素リン酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）25によってアセチルCoAを産生するために使用される。, 一方、ホルムアルデヒドは二酸化炭素とformate26を還元するか、メタンとmethanol27を酸化することによって得ることができる。 これにより，ホルムアルデヒドや他の一炭素資源からのアセチルＣｏａの生合成を実現できた。
SACA経路の説明と計算解析。 a saca経路が赤いパネルで強調表示されました。 主原料のホルムアルデヒドからメタノール、ギ酸でメタン、CO2となりました。, アセチルCoAの生成物は、主要な細胞栄養素を生成するために使用することができる。 bアセチルCoA合成のための三つの設計された経路の熱力学データは、平衡器のウェブサイト（http://equilibrator.weizmann.ac.il）によって生成された。, ΔrG’m:総ギブスエネルギー変化;ステップ:研究経路におけるホルムアルデヒドからアセチルCoAへの反応の数;MDF:最大駆動力;収率:研究経路における炭素の総収量;補酵素:補酵素の数は、研究経路において使用される
熱力学は、経路がin vivoまたはin vitroで効果的に行うことができるかどうかを反映することができる。 設計したＳＡＣＡ経路の熱力学的化学駆動力を計算した。, ホルムアルデヒドからアセチルCoAへの全体的な反応は非常に熱力学的に有利であり、反応全体の総ギブスエネルギー変化（ΔrG’m）は約-96.7kJ mol-1である。 1bおよび補足表1)。 MDF（最大駆動力）の値は、通常、異なる経路の熱力学的および速度論的品質を評価するために使用されます28。 MDFが十分に高い場合、経路には、in vivoでの動作を妨げる熱力学的ボトルネックは含まれていません。 SACA経路は26の比較的高いMDF値を得た。,FLSおよびMCC経路よりも明らかに高い9kJ mol−1（それらのMDF値はそれぞれ1.9および5.8kJ mol−1である）。 したがって，ＳＡＣＡ経路はホルムアルデヒドからのアセチルＣｏａの生合成に熱力学的に有利である。
C1からC2への新規酵素の同定
ホルムアルデヒドの縮合は、chemistry29、30におけるN-複素環カルビンによって触媒することができる。 生物学において、補因子チアミン二リン酸（ThDP）のチアゾリウム環は同様の機能を有し、一方のアルデヒドを活性化し、他方のアルデヒドと二量体を形成することができる31。, ホルムアルデヒドの二つの分子をグリコールアルデヒドの一つの分子に凝縮する酵素を見つけるために、ThDP依存性酵素の触媒機構を参照し、thdp、グリコールアルデヒド、および反応のための電子を提供するグルタミン酸を含むテオザイムモデルを構築した32(Fig. 2a）。 タンパク質データバンク（PDB）内のすべての酵素は、事実上テオザイムモデルに基づいてスクリーニングされ、リガンドThDPを有する37の非冗長タンパク質構造 1および補足のノート）。, ThDP依存性酵素の触媒機構によれば33,34,35、Thdp中のC2原子が活性中心である。 C2原子とグリコールアルデヒドの生成物との間の距離は、触媒反応を引き起こすために重要である（Fig. 2a）。 したがって、各候補タンパク質におけるC2原子とグリコールアルデヒドの間の距離を分析した。
グリコールアルデヒド合成酵素のテオザイムモデル構築と機能同定。, aグリコールアルデヒドと異なるThDP依存性酵素の活性中心との間のテオザイムモデル相互作用。 グルタミン酸（glu）は黄褐色であり、グリコールアルデヒドはシアンであり、ThDPは緑色である。 ThDP中のC2原子とグリコールアルデヒド炭素原子の間の距離はd1とd2で表される。 緑色の点はマグネシウムイオンです。 b各タンパク質におけるd1とd2の間の平均距離（青）が左に示されている。 試験したタンパク質の生成物（黄色）の量は右に示されています。 反応は、試験したタンパク質の1mg mL−1および2g L−1ホルムアルデヒドを添加することにより行った。 ND検出なし。, エラーバーはs.d.(標準偏差)、n=3を表します。 1MLの1OD細胞を用いて三つの機能候補のcタンパク質発現。 M：タンパク質マーカー；1、3および5は、それぞれ2UZ1、3FZNおよび4K9Qに対するIPTGなしのタンパク質発現を表し、2、4および6は、それぞれ2UZ1、3FZNおよび4K9Qに対するIPTG誘導下のタンパク質発現を表し、赤い矢印は、それぞれ2UZ1、3FZNおよび4K9Qに対するタンパク質バンドを指す。 ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。,
分子ドッキング（補足データ1）36を用いた各タンパク質の平均距離に基づいて、短距離と明確な機能注釈を有する六つの候補を候補として定 図2bおよび補足表2）。 さらに，長い距離を有する三つの蛋白質を対照としてランダムに選択した。 候補および対照を発現および精製して，ホルムアルデヒドからグリコールアルデヒドを産生する能力を試験した。, 三つのコントロールは、C2原子とグリコールアルデヒドとの間の距離がホルムアルデヒドの縮合に重要な役割を果たしていることを示す、機能を持っ 三つのアクティブな候補の中で、ベンズアルデヒドリアーゼ（BAL）と呼ばれていたタンパク質2UZ1（https://www.rcsb.org/structure/2UZ1）は、ホルムアルデヒドの濃度が低いときにグリコールアルデヒドの最小収率にもかかわらず、優先的にジヒドロキシアセトン（DHA）を生成することが報告された37。, The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
グリコールアルデヒドシンターゼの指向進化
BALはホルムアルデヒド22からDHAを産生するように設計されていたので、BFDの対応する変異も酵素活性の改善に寄与するかどうかを検出することを提案した（補足図。 2). すべての変異残基をスクリーニングすることにより、我々は確かにBFDの基質チャネルに位置していた高度に活性な変異W86R-N87Tを発見した（補足図。 3). したがって、この変異（W86R-N87T）はBFDに導入され、変異体はM1としてマークされた。, さらにBFDの触媒活性を向上させるために、我々は、単一点飽和変異誘発を行うために活性中心から25Åの距離内の8位置が選択されたBFDの活性中心の周 4). グリコールアルデヒドとジフェニルアミンとの発色反応によりグリコールアルデヒドを検出するためのハイスループットスクリーニングアプローチを開発し、650nmで分光光度モニターによって測定した。 5)., スクリーニング後、我々は14のうち25の位置がM1変異体よりも高い活性を示したことを見出した（補足図。 6). その後、14の位置は8つのグループに分けられた：A（N27/G402）、B（N27/S236）、C（N27/A460）、D（F397/C398）、E（L109/L110）、F（H281/Q282）、G（N374/S378）、およびH（T379/T380）。 この位置の変種が最も高い活性を示したので、N27は三回使用された。 テンプレートとしてM1を使用して、M1に変異の各グループを導入し、M2として標識された最高の活性変異体を選択しました。, これらの位置の間で反復組み合わせ変異誘発の三ラウンドを実行することにより、我々は完全に64,512クローンをスクリーニングし、アクティブセンターの周り 最後に、7残基の変異を持つ変異体は、グリコールアルデヒドシンターゼ（GALS）と命名された。 GALSのkcatは約160倍に改善され、GALSの最終触媒効率は9.6m−1·s−1であり、これは出発酵素よりも約70倍である（Fig. 図3aおよび補足図。 7).
グリコールアルデヒド合成酵素のタンパク質工学とメカニズム解析。 ＷＴおよび突然変異体の速度論的パラメータである。 WT:野生型;M1:W86RおよびN87Tの変異;M2:W86R、N87T、L109GおよびL110Eの変異;M3:W86R、N87T、L109G、L110EおよびA460Mの変異;M4:W86R、N87T、L109G、L110E、A460M、H281VおよびQ282Fの変異。b活性中心における選択された五つの変異の概要。 IMA:中間類似体;オレンジ色の線はIMAの水酸基と突然変異L110Eとの間の水素結合を示す。, C M1、M2、M3およびM4のポケットボリューム。 ピンクのドットは、結合ポケット（補足データ2）の体積を表し、それぞれ131.25、161.50、133.38、および171.38Å3である。 した数値を使用して描画校のキメラソフトウェアのバージョン1.1246. ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。
これらの変異が酵素活性をどのように改善するかを把握するために、我々はGALSの結晶化をやり直すことを提案した。 アクティブポケットはGALS38のホモ二量体の界面に位置する。, タンパク質の構造のギャルとは異なる開始タンパク質の後、数回の突然変異が原因です。 ここでは、GALSのタンパク質を結晶化させ、BFDの構造を探索モデルとしてGALSの結晶構造を検索しました（補足表3）。 GALSの結晶構造を解析した（補足図。 図8に示すように、補足図。 9). 我々は、L110Eの変異は、遷移状態を安定化し、生成物と補因子ThDP間のC–C結合を切断するのに寄与する可能性がある中間類似体（IMA）のヒドロキシル基に二つの追加の水素結合を導入することがわかった（Fig。 3）。, L109Gの変異は、大きなイソブチル基を水素基に置き換えることによって、基質結合ポケットの体積を拡大した。 A460Mの第三の突然変異は、基質の方向を変え、次にThDPと基質との間の相互作用を高めることができる。 最後の二つの変異H281VおよびQ282Fは、外面の細孔半径を拡大し、基質または生成物のアクセスを容易にすることができる（図。 3c）。 M1と比較して、GALS中の反応ポケットの体積は30％以上拡大し、これが触媒活性の改善の主な理由である。,
アセチルリン酸合成酵素の同定
自然界では、グリコールアルデヒドからAcPの合成を達成する酵素は報告されていない。 ホスホケトラーゼ(PKs)は、フルクトース-6-リン酸(F6P)またはキシルロース-5-リン酸(X5P)39からAcPを生成することができる。 PKsの触媒機構によれば、グリコールアルデヒドがThDPと相互作用し、2-α,β-ジヒドロキシエチリデン-ThDP(DHEThDP)を生成する可能性がある（Fig. PksによってF6PかX5PからのAcPの形成の主中間体である4a）。 この仮説を確認するために、八つの候補を選択しました。, 4b)111細菌ファミリーからのPKsの系統樹に基づく(補足図. 10). 遺伝子合成およびタンパク質精製後（補足図。 11)、我々は基質としてグリコールアルデヒドを用いてすべての候補蛋白質の触媒活性を調べた。 幸いなことに、八つのPKsのうち五つは重要な触媒活性を示した。 PK1、PK4、およびPK8のみがブランクコントロールと有意な差を示さなかった。 したがって、最も高い活性を有するPK2は、そのkcat/Kmが3.21m-1·s−1に達成するアセチルリン酸シンターゼ（ACPS）と呼ばれた（補足図。 12).,
アセチルリン酸合成酵素の計算解析と機能同定。 A F6P/X5PおよびグリコールアルデヒドからのDHEThDPの形成。 固体の矢印は、refのDHEThDPの形成メカニズムを表しています。 図39;破線の矢印は、基質としてグリコールアルデヒドを用いた予測プロセスを示す。 B ACPの識別。 選択された八つのPKsの最尤系統樹はMEGA47によって構築されました。, 選択されたＰｋの詳細は、補足注記および補足図に記載されている。 10. 各タンパク質の活性は、0.5mg mL−1酵素および10mMグリコールアルデヒドを添加することによって検出された。 AcPアセチルリン酸、PKホスホケトラーゼ、AcPの産生（μmol min−1mg−1）：毎分mg酵素当たりのAcP産生の量;対照：反応系に酵素を添加しなかった;誤差棒はs.d.（標準偏差）、n=3を表す。 C DHEThDP形成プロセスのエネルギープロファイル。, IM1およびIM2は形成プロセス中の中間体1および2を表し、TIMはIM1およびIM2の間の互変性化中間体を表し、TS1およびTS2は遷移状態を表す。 ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。
グリコールアルデヒドからDHEThDPを形成するメカニズムを明らかにするために、PK40の以前の計算モデルに基づいて理論解析を行うことを提案した。 Ｄｈｅｔｈｄｐの形成に関連する全ての可能なアミノ酸を、計算モデルを構築するために使用した（補足図。 13)., 計算シミュレーションに基づいて、エネルギー障壁はわずか11.36kcal mol−1IM1(中間体1)の形成のためにグリコールアルデヒドがHis553によってプロトン化されたとき、最も可能なプロトンdonor40と考えられていることがわかった。 4c）。 その後、IM1はIM2にGlu479およびGlu437の助けを借りて互変異性化する。 IM2はIM1よりもエネルギー的に安定である。 IM2のプロトンがThdpでN4’によって除去されたとき、IM2から主要な中間DHEThDPへのエネルギー障壁は15である。,13kcal mol-1は、f6pを基層としてDHEThDPの形成中の歪みエネルギーと同様である40。 Ｄｈｅｔｈｄｐの形成後、以下の触媒プロセスは他のＰｋと同じである（補足図。 14)、すなわち、H97はDHEThDPの脱水プロセスのプロトンの提供者として機能し、His142およびGly155はHis142およびGly155が後脱水の中間物(AcThDP)の構造の水分子が付いている水素結合を形作るという事実から判断するDHEThDPの脱水プロセスを加速します。, His64、Tyr501、およびAsn549はPiによる求核攻撃に重要であり、それらは一緒にPi39の結合部位を形成する。 部位特異的突然変異誘発実験はまた、これらの残基が酵素活性にとって極めて重要であることを示した（補足図。 15).
in vitroでホルムアルデヒドからのアセチルCoAの合成
GALSとACPSの最初の成功した設計では、我々はホルムアルデヒドからアセチルCoAを合成するためにin vitroでSACA経路を構築することを意図した。 まず，異なる濃度のホルムアルデヒド下でのＧＡＬＳによるグリコールアルデヒドの収率を測定した。, その結果、GALSはホルムアルデヒドの二量化を効果的に触媒することができ、グリコールアルデヒドの収率は基質の濃度が改善されるにつれて増加することが分かった。 5a）。 例えば、ホルムアルデヒドからのグリコールアルデヒドの収率は、45％から0.5g L−1で80％に2g L−1で増加した。 次に、グリコールアルデヒドからAcPへの触媒効率を調べましたが、AcPは急速に酢酸に分解されるため、酢酸の含有量によって定量されました（補足図）。 16)23., その結果、AcPの収率は、ACPSを介して異なる濃度のグリコールアルデヒド下で80％以上に達することが示された（補足図。 17). 残念ながら、ACPSはホルムアルデヒドによって明らかに阻害された。 5b）。 したがって、この紛争を解決するためには、ホルムアルデヒドの濃度のバランスを取る必要があります。
in vitroでSACA経路によるホルムアルデヒドからのアセチルCoAの生合成を確認する。 A GALSによるホルムアルデヒドからのグリコールアルデヒドの合成。, 反応は、異なるホルムアルデヒド濃度の下で実行されました2mg mL−1精製GALS37℃で2h.bホルムアルデヒドによるACPSの阻害。 酢酸の収率は、反応緩衝液、2mg mL-1ACPS、0.75g L-1グリコールアルデヒドおよび異なる色線で表された0から2g L−1までのホルムアルデヒドの勾配 異なったホルムアルデヒドの集中からの酢酸のCの収穫。 反応は、37℃で反応緩衝液、2mg mL−1GALS、2mg mL−1ACPSおよび0からのホルムアルデヒドの勾配を用いて一晩行った。,5へ2g L-1. 1g L-1ホルムアルデヒドからの酢酸またはアセチルCoAのD収率。 酢酸またはアセチルＣｏａの収率を異なる時点で測定した。 青い線はアセチルCoAを生成する反応系を表し（20mm CoAを供給し、精製されたGALS、ACPS、およびPTAの2mg mL-1をそれぞれ含む）、オレンジ色の線は酢酸を生成する反応系を表す（2mg mL−1GALSおよびACPSを含み、CoAを供給しない）。 すべてのアッセイ中の試料をＨＰＬＣによって分析した。 エラーバーはs.d.(標準偏差)、n=3を表します。, ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。
ホルムアルデヒドの濃度を最適化するために、GALSおよびACPSの2mg mL−1を含む反応系を用いて勾配実験を行った。 ホルムアルデヒドの濃度を増加させるにつれて、系中の酢酸の収率は最初に増加し、次いで減少した（図。 5c）。 ホルムアルデヒドの濃度が1g L−1の場合、酢酸の収率は50.6％に達した。, 興味深いことに、酢酸の最終収率は、同じ量のホルムアルデヒドでグリコールアルデヒドからAcPへの反応系のそれよりもさらに高い（Fig. 5b、グレーライン）。 これにより一部の機能のACPSからホルムアルデヒドが徐々に消費が登場。 このシステムに基づいて，ＡｃｐをアセチルＣｏａに変換する別の既知の酵素りん酸アセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）をさらに添加した。 最後に、SACA経路は5.5mmのアセチルCoAを1g L-1のホルムアルデヒド濃度で産生した。 ホルムアルデヒドからのアセチルCoAの収率は約33％であった。 5d）。, しかし、PTAおよびCoAが供給されなかった場合、ホルムアルデヒド（7.8mM）からの酢酸（33.3mM）の収率は50％に達した。 酢酸よりもアセチルＣｏａの収率が低いことは，アセチルＣｏａとＡｃｐの不安定性によるものと考えられた。 これらの結果は，ｉｎｖｉｔｒｏでＳＡＣＡ経路によるホルムアルデヒドからのアセチルＣｏａの生合成に成功したことを示した。,
13C標識によるSACA経路の検証
in vitroで精製酵素によるSACA経路を確認した後、さらに13C代謝トレーサーアッセイによるin vivoでのsaca経路からのアセチルCoAおよびそれの誘導体の生合成を試験することを試みた。 6a）。 まず、細胞溶解物は、13C標識ホルムアルデヒドとCoAの添加によるアセチルCoAの生合成を確認するために使用されました。 我々は、他の対照よりも二重13C標識アセチルCoAの有意な増加を検出した（P値<0.001、T検定）（図。 図6bおよび補足図。 18)., さらに、ACPSやPTAなどのSACA経路における遺伝子のいずれかを省略すると、二重13C標識アセチルCoAの増加は消失した（補足図。 19). さらに、アセチルCoAはオキサロ酢酸と収束してトリカルボン酸（TCA）サイクルに入る。 我々はまた、有意により多くの二重13C標識フマル酸塩（P値<0.001、Tテスト）とリンゴ酸塩（P値<0.001、Tテスト）SACA経路と13C標識 図6bおよび補足図。 18)., しかし，高次質量同位体異性体における有意差は検出できなかった。 これは、TCAサイクルにおける二重13C標識された同位体の量が少ないことによって引き起こされるであろう。
SACA経路の13C標識代謝トレーサー分析。 13C標識トレーサーの試験経路の概略図。 b細胞溶解物中のm+2化合物の画分13C標識または標識されていないホルムアルデヒド。 c13C標識された代謝産物の画分。, 細胞はLBで誘導され、M9培地13C標識メタノールを含むに転送されました。 細胞内の代謝物の検出された後16h孵proteinogenicアミノ酸を測定した後26h。 検出された同位体の合計を100％とした。, 13C-FALD13C標識ホルムアルデヒド、m+0 13c標識なし、m+1単一13C標識、m+2二重13C標識、FALDホルムアルデヒド、MeOHメタノール、GALDグリコールアルデヒド、AcPアセチルリン酸、Aspアスパラギン酸、Gluグルタミン酸、PEPホスホエノールピルビン酸、SACA株はベクター GALS-ACPS-PTA-28a、28a株は28aの空ベクターを含み、BsMDH-SACA株はbsmdh-PTA-28a株の両方を含む。PCDFおよびGALS-ACPS-pta-28aベクトル、BSMDH-28a:歪みにはbsmdh-PCDFベクトルと空のベクトル28aの両方が含まれています。エラーバーはS.d.(標準偏差)、n=3を表します。, ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。
その後、セル内の炭素流量をテストすることを提案しました。 細胞に対するホルムアルデヒドの毒性のために、我々はin vivoでホルムアルデヒドの継続的に低い濃度を維持するためにBacillus stearothermophilus（BsMDH）41からメタノールデヒドロゲナーゼ 6a）。 培養細胞を異なる時点で採取し、タンパク質生成アミノ酸および細胞内代謝物を検出するために使用した（Fig. 6c）。, 我々は、SACA経路（BsMDH-SACA）と株は、TCAサイクルに由来するより多くの二重13C標識アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれていることがわかった。 さらに、糖新生経路を介して二重13C標識オキサロ酢酸から生成するかもしれない13C標識グルコースとホスホエノールピルビン酸は、対照株（BsMDH-28a）のものよりもひずみBsMDH-SACAでより検出された。 ＳＡＣＡ経路はホルムアルデヒドからアセチル-Ｃｏａおよびアセチル-Ｃｏａ由来の代謝産物を産生するために機能的であることを示した。,
細胞増殖によるSACA経路の評価
in vivoでSACA経路をさらに評価するために、経路内の各中間体を供給することにより、細胞増殖を段階的にテストすることを提案した。 最初は大腸菌が豊富な培地の下で成長し、次にグリコールアルデヒドが補足炭素源として添加された。 異なる濃度のグリコールアルデヒド（補足図。 20)、0を超えるSACA経路を含む操作株であることがわかった。,4g L-1グリコールアルデヒド供給は、グリコールアルデヒドまたはSACA経路を持たない株よりも著しく高いOD600を有する（Fig. 図7aおよび補足図。 21). バイオマス（細胞乾燥重量、CDW）へのグリコールアルデヒドの寄与は0.681±0.028gCDWg−1（n=3）グリコールアルデヒドであった。
細胞増殖によるSACA経路の評価。 補足炭素源として0.4g L−1グリコールアルデヒドを使用して細胞増殖アッセイ。, 補足炭素源として80mg L−1ホルムアルデヒドを用いたb細胞増殖アッセイ。 補足炭素源として8g L−1メタノールを用いたc細胞増殖アッセイ。 細胞を最初にＬＢ培地中で培養した。 タンパク質発現を誘導するためにIPTGを添加し、次いで補足炭素源を添加した。 OD600は異なる時点で検出された。, SACA株はベクター GALS-ACPS-PTA-28a、28a株は28aの空のベクターを含み、BsMDH-SACA株はBsMDH-pCDFとGALS-ACPS-PTA-28aベクターの両方を含み、BsMDH-28a株はBsMDH-pCDFベクターと空のベクター28aの両方を含み、GALS株はGALSを除く経路内のすべての遺伝子を含み、+補足炭素源を添加し、−補足炭素源を含まない、グリコールアルデヒド(GALD)、ホルムアルデヒド(holmaldehyde)、グリコールアルデヒド(GALD)、ホルムアルデヒド(holmaldehyde)、ホルムアルデヒド（ファルド）、メタノール（MEOH）。 エラーバーはs.d.(標準偏差)、n=3を表します。 ソースデータの提供については源泉としてのデータファイルです。,
補足炭素源としてホルムアルデヒドを用いて細胞増殖を試験したところ、空ベクターによる株の成長は、ホルムアルデヒドの80mg L−1によって 7b）である。 ＳＡＣＡ経路を含む株は最初に阻害され、その後同じ条件下で正常に成長したが、これは空ベクターを有する株よりもホルムアルデヒド消費速度が速いことによって引き起こされる可能性がある（補足図）。 22)., Ｓａｃａ経路を含む株は，ホルムアルデヒドを含まない株よりもホルムアルデヒドを補うバイオマスが多かった。 これらの結果は、SACA経路がより効率的な除去に有毒ホルムアルデヒドするだけでは不十分で提供します。
最後に、我々は連続的にホルムアルデヒドに変換されるメタノールを供給することによってSACA経路を評価することを意図した。 我々は、BsMDHおよびSACA経路の両方を含む株は、メタノール供給またはSACA経路のない対照よりも高いOD600を有することを見出した（Fig. 図7cおよび補足図。, 23). 26時間インキュベーション後、我々は、BSMDHとSACA経路の両方を含む株におけるOD600の値が約0.2増加し、SACA経路のない株よりも有意に高いことがわかった（P値=0.005、 SACA経路のない株と比較することにより、我々はメタノール由来のバイオマスの量が0.03±0.006gCDW g−1（n=3）SACA経路を含む株でメタノールであることがわかった。