オキシダーゼテストは、細菌と酸化還元色素-テトラメチル-p-フェニレン-ジアミン中の電子ドナー間の電子の輸送を触媒するシトクロムオキシダーゼ系の存在を検出する。 染料は深い紫色に減ります。, このテストが酵素のシトクロムオキシダーゼを作り出すPseudomonas、Neisseria、Alcaligens、Aeromonas、Campylobacter、ビブリオ、ブルセラおよびPasteurellaの同一証明で助けるのに使用されています。

この試験には多数の試薬を使用することができる。,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., 呼吸鎖の一部としてシトクロムcを含む生物はオキシダーゼ陽性であり、試薬を青色/紫色に変える。 呼吸鎖の一部としてシトクロムcを欠いている生物は試薬を酸化せず、試験の範囲内で無色のままにし、オキシダーゼ陰性である。

オキシダーゼ陽性細菌は、シトクロムオキシダーゼまたはインドフェノールオキシダーゼ（鉄を含むヘモタンパク質）を有する。 これらの両方は、ドナー化合物（NADH）から電子受容体（通常は酸素）への電子の輸送を触媒する。, テスト試薬、N、N、N’、N’-tetramethyl-p-phenylenediamineの二塩酸塩は酵素のオキシダーゼのための人工的な電子アクセプターとして機能します。 酸化された試薬は着色された混合物のindophenolの青を形作ります。

シトクロム系は、通常、最終水素受容体として酸素を利用することができる好気性生物にのみ存在する。 この代謝の最終生成物は、水または過酸化水素（カタラーゼによって分解される）のいずれかである。

オキシダーゼ試験の目的/用途

• オキシダーゼ試験は、生物がシトクロムオキシダーゼ酵素を有するかどうかを決定するために使用される。,
• テストはNeisseria、Moraxella、CampylobacterおよびPasteurella種（オキシダーゼ陽性）の微分のために援助として使用されます。
• これは、シュードモナスを関連種から区別するためにも使用されます。

オキシダーゼ試験の手順

オキシダーゼ試験には多くの方法のバリエーションがあります。 これらには、濾紙試験、直接板法、スワブ法、含浸オキシダーゼ試験ストリップ法および試験管法が含まれるが、これらに限定されるものではない。 すべての時間と濃度は、元の推奨事項に基づいています。,

乾燥ろ紙法

オキシダーゼ試薬は不安定で、使用するために新たに調製する必要があるため、この方法は便利です。

1. WhatmanのNo.1ろ紙のストリップを、新たに調製したテルトラメチル-p-フェニレン-ジアミン二塩酸塩の1％溶液に浸漬する。
2. 約30秒間排水した後、ストリップを凍結乾燥し、スクリューキャップでしっかりと密封された暗いボトルに保存する。
3. 使用するために、ストリップを取り除き、ペトリ皿に置き、蒸留水で湿らせる。,
4. 試験されるコロニーを白金ループで拾い上げ、湿った領域に塗抹する。
5. 陽性反応は、5-10秒以内に現れる強い深紫色の色相、10-60秒以内に着色による”遅延陽性”反応、および着色の欠如または60秒以降に着色による陰性反応によって示される。

湿式濾紙法

1. 濾紙のストリップは、試薬の少し新しく作られた1％溶液で浸漬されます。
2. 文化の斑点が白金のループでこすられます。,
3. 陽性反応は、5-10秒以内に現れる強い深紫色の色相、10-60秒以内に着色による”遅延陽性”反応、および着色の欠如または60秒以降に着色による陰性反応によって示される。

ダイレクトプレート法

1. 寒天プレート上の疑いのあるコロニーに直接試薬2-3滴を加えます。 試薬が付いている版をあふれさせないで下さい。
2. 10秒以内に色の変化を観察します。

注：直接プレート法は、非選択的寒天プレート上で実施する必要があります。,

1. Kovacのオキシダーゼ試薬を使用すると、5-10秒以内に色が濃い紫色に変化すると、微生物はオキシダーゼ陽性になります。 微生物は60から90秒以内に紫色に色が変わるときオキシダーゼの陽性を遅らせます。 色が変わらなかったり、2分以上かかったりすると、微生物はオキシダーゼ陰性となります。
2. GordonおよびMcLeod試薬を使用する場合、微生物は、色が10-30分以内に赤色に変化するか、60分以内に黒色に変化するとオキシダーゼ陽性である。 色が変わらなければ微生物はオキシダーゼ陰性である。,

綿棒メソッド

1. 綿棒を試薬に浸し、孤立した疑わしいコロニーに触れます
2. 10秒以内に色の変化を観察します。

試験管法

1. 新鮮な培養物（18-24時間）の細菌を4.5mlの栄養培養液（または高濃度の糖を含まない標準培地）で増殖させる。
2. 0.2mlの1%α-ナフトールを加え、次いで0.3mlの1%p-アミノジメチルアニリンシュウ酸塩（GabyおよびHadley試薬）を加える。
3. 培養物の混合および完全な酸素化を確実にするために、激しく振ってください。,
4. 色の変化を観察します。
5. 微生物は、15-30秒以内に色が青色に変化するとオキシダーゼ陽性である。 微生物は、2-3分以内に色が紫色に変化すると、オキシダーゼ陽性に遅れる。 色が変わらなければ微生物はオキシダーゼ陰性である。

オキシダーゼ試験の結果の解釈

陽性結果

深い紫色-青色/青色の発達は、5-10秒以内にオキシダーゼ産生を示す。

ネガティブな結果

紫-青の色なし/色の変化なし。,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

オキシダーゼ試験の品質管理

陽性対照:緑膿菌ATCC27853

陰性対照:大腸菌ATCC25922

オキシダーゼ試験の制限

1. オキシダーゼ試験で使用される試薬は自動酸化することが示されているので、1週間以上経過しない新鮮な試薬を使用することが非常に重要である。
2. 高濃度のグルコースを含む培地上で増殖した細菌および酵母の両方が、オキシダーゼ活性を阻害したので、栄養寒天のような過剰な砂糖を含まない培地上で増殖したコロニーを試験することが推奨される。, トリプティック大豆寒天も優れた培地です。
3. 色素を含む培地上で増殖した細菌は、異常な結果を与える可能性がある。
4. 試験試薬は微生物を効果的に殺すので、任意の試薬を活性培養物に添加する前に、副培養を行うべきである。
5. 試験試薬は、微生物を殺
6. オキシダーゼテストはNeisseriaの推定同定とグラム陰性のバチルスの微分そして同一証明で使用することができます。 キシラーゼ活性とオキシダーゼ陽性生物についての検討が必要であるによりグラム染めの形態およびグ反応を行います。, 完全な同定のためには、追加の生化学的試験が推奨される。
7. ニクロムまたは他の鉄containing有ループの使用は、偽陽性反応をもたらす可能性がある。 プラチナループをお勧めします。
8. ほとんどのヘモフィルスはオキシダーゼ陽性である。 感度帯または試薬には偽陰性ます。
9. グラム陰性桿菌のオキシダーゼ反応は、有効な結果を確実にするために、非選択的および非差動的培地上で決定されるべきである。 また、コロニーからメディアを含む高レベルのブドウ糖が偽陰性反応です。,
10. 18-24時間齢のコロニーを使用することをお勧めします。 古いコロニーは弱い反応を生成します。
11. 20秒後に表示される色の変化は無視する必要があります。